Vigu tegev PCR meetod
Uuritava geeni järjestusse on võimalik mutatsioone sisse viia kasutades vigu tegevat polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) meetodit. Termostabiilse DNA polümeraasi reakstioonisegusse lisatakse Mn2+ ioone ning muudetakse desoksünukleotiidide suhet (dATP:dCTP:dGTP:dTTP on 2,8 : 4,5 : 1 : 7 tavapärase 1:1:1:1 asemel). Sellistel tingimustel lülitab polümeraas aeg-ajalt sisse vale nukleotiidi. Saadud mutantsete alleelide funktsionaalsust saab analüüsida kasutades plasmiidi-vahetamise meetodit.
Plasmiidi-vahetamise meetod
koosneb 4 etapist (Joonis 7). Esimeseks etapiks on spetsiaalse vastuvõtva tüve
konstrueerimine. Diploidses tüves deleteeritakse uuritava geeni üks
alleelidest (GEEN X / 
geen X). Seejärel transformeeritakse nendesse rakkudesse URA3 markergeeniga plasmiid, millelt ekspresseerub metsiktüüpi alleel GEEN X. Saadud diploidid sporeleeritakse. Tetraadide analüüsi kasutades isoleeritakse haploidne tüvi, kelle genoomis on uuritava geeni null mutatsioon ning kes sisaldab ka URA3 markergeeniga plasmiidi. Teiseks etapiks on mutatsioonide indutseerimine GEEN X järjestusse. Kasutatakse vigu tegevat PCR meetodit. Saadadud DNA fragmendid kloonitakse plasmiidi, mis sisladab teist markergeeni (näiteks LEU2). Tulemuseks on plasmiidide raamatukogu, mis sisaldab juhuslikke mutatsioone uuritavas geenis (geen X*). Kolmandaks etapiks on vastuvõtvasse tüvesse mutatsioonidega geen X* alleele sisaldava plasmiidse raamatukogu transformatsioon. Transformantide selektsiooniks kasutatakse selektsioonimarkerit LEU2. Neljandas etapis külvatakse saadud transformandid edasi 5-fluoro-oroothapet (5-FOA) sisaldavale söötmele, kus toimub URA3 markergeeni vastuselektsioon. Rakud kaotavad URA3 plasmiidi ning seega ka metsiktüüpi geeni alleeli. Alles jääb LEU2 selektsioonimarkeriga plasmiid, mis sisaldab erinevaid geeni mutantseid alleele geenX*. Saadud kolooniad külvatakse piiravale kasvutingimusele ning isoleeritakse geenX* konditsionaalsed alleelid. Sellist meetodit kasutatakse sagedasti just temperatuuritundlike alleelide isoleerimiseks. Hiljem saab need mutantsed alleelid integreerida kromosoomi.
geen X). Seejärel transformeeritakse nendesse rakkudesse URA3 markergeeniga plasmiid, millelt ekspresseerub metsiktüüpi alleel GEEN X. Saadud diploidid sporeleeritakse. Tetraadide analüüsi kasutades isoleeritakse haploidne tüvi, kelle genoomis on uuritava geeni null mutatsioon ning kes sisaldab ka URA3 markergeeniga plasmiidi. Teiseks etapiks on mutatsioonide indutseerimine GEEN X järjestusse. Kasutatakse vigu tegevat PCR meetodit. Saadadud DNA fragmendid kloonitakse plasmiidi, mis sisladab teist markergeeni (näiteks LEU2). Tulemuseks on plasmiidide raamatukogu, mis sisaldab juhuslikke mutatsioone uuritavas geenis (geen X*). Kolmandaks etapiks on vastuvõtvasse tüvesse mutatsioonidega geen X* alleele sisaldava plasmiidse raamatukogu transformatsioon. Transformantide selektsiooniks kasutatakse selektsioonimarkerit LEU2. Neljandas etapis külvatakse saadud transformandid edasi 5-fluoro-oroothapet (5-FOA) sisaldavale söötmele, kus toimub URA3 markergeeni vastuselektsioon. Rakud kaotavad URA3 plasmiidi ning seega ka metsiktüüpi geeni alleeli. Alles jääb LEU2 selektsioonimarkeriga plasmiid, mis sisaldab erinevaid geeni mutantseid alleele geenX*. Saadud kolooniad külvatakse piiravale kasvutingimusele ning isoleeritakse geenX* konditsionaalsed alleelid. Sellist meetodit kasutatakse sagedasti just temperatuuritundlike alleelide isoleerimiseks. Hiljem saab need mutantsed alleelid integreerida kromosoomi.
Joonis 7. Mutantsete alleelide isoleerimine vigu tegeva PCR meetodi ja plasmiidi-vahetamise meetodi abil.