Kasutatavad plasmiidid
Schizosaccharomyces pombe rakkudes töötavad plasmiidid on kõik süstik-vektorid (vt. Pärmigeneetika: pärmides kasutusel olevad plasmiidid, plasmiidi-vahetamise meetod). Süstik-vektorid sisaldavad järjestusi, mis on vajalikud plasmiidi replikatsiooniks ja selektsiooniks bakteris E. coli. Samuti sisaldavad nad järjestusi, mis tagavad plasmiidi säilimise, pärandumise ja selektsiooni pärmis.
Episomaalse plasmiidid sisaldavad järgmisi geene ja DNA elemente (Joonis 18A):
S. pombe süstik-vektoreid jagatakse:
- episomaalsed plasmiidid
- replitseeruvad plasmiidid
- ekspressiooniplasmiidid
- bakterirakus töötavat replikatsiooni alguspunkti (ori)
- bakterirakus töötavat selektsioonimarkerit (AmpR)
- pärmirakus töötavat selektsioonimarkerit (LEU2, leu1+, ura4+)
- pärmirakus töötavat replikatsiooni alguspunkti 2
plasmiidist - polülinker (MCS)
Replitseeruvad plasmiidid sisaldavad järgmisi geene ja DNA elemente (Joonis 18B):
Episomaalsed ja replitseeruvad plasmiidid on kõrge koopia arvuga plasmiidid. S. pombe rakkudes ei saa kasutada tsentromeerseid plasmiide, sest S. pombe tsentromeeerne järjestus on liiga pikk, et seda süstik-vektorites kasutada.
- bakterirakus töötavat replikatsiooni alguspunkti (ori)
- bakterirakus töötavat selektsioonimarkerit (AmpR)
- pärmirakus töötavat selektsioonimarkerit (LEU2, leu1+, ura4+)
- autonoomselt replitseeruvat järjestust pärmi kromosoomist (ars1)
- polülinker (MCS)
Ekspressiooniplasmiidid sisaldavad järgmisi geene ja DNA elemente (Joonis 18C):
- bakterirakus töötavat replikatsiooni alguspunkti (ori)
- bakterirakus töötavat selektsioonimarkerit (AmpR)
- pärmirakus töötavat selektsioonimarkerit (LEU2, leu1+, ura4+)
- autonoomselt replitseeruvat järjestust pärmi kromosoomist (ars1) või replikatsiooni alguspunkti 2 plasmiidist
- pärmirakus töötavat promootorjärjestust
- pärmirakus töötavat terminaatorjärjestust
Nendes plasmiidides kasutatakse nii konstitutiivseid kui ka reguleeritavaid promootorjärjestusi (vt. Pärmigeneetika: pärmitüvede genotüübid, tüvede kasvatamiseks kasutatavad söötmed). Kõige levinum reguleeritav promootor on nmt1 promootor. See promootor on represseeritud tiamiini (vitamiin B1) poolt. Promootori aktivatsiooniks on vaja tiamiin söötmest eemaldada.
-laktamaasi geen; ori, E. coli replikatsiooni alguspunkt; ura4+, pärmi selektsioonimarker; MCS, polülinker; 2 ori, replikatsiooni alguspunkt 2 plasmiidist; ars1, autonoomselt replitseeruv järjestus pärmi kromosoomist; P, promootorjärjestus; T, terminaatorjärjestus.