Probleemülesanne I

Probleemülesanne I

GEEN X on pagaripärmi Saccharomyces cerevisiae eluks hädavajalik geen. Selle geeni deletsioon on letaalne, st. pärmirakud ei suuda kasvada rikkal söötmel 30 ^oC juures. Poolduva pärmi Schizosaccharomyces pombe genoomis on geenY⁺, mis andmebaaside järgi on GEEN X homoloog.

Kuidas uurida eksperimentaalselt kas S. cerevisiae GEEN X ja S. pombe geenY⁺ on funktsionaalselt sarnased?
Millist meetodit kasutada?
Millised süstik-vektorid ja pärmitüvi tuleks katse läbi viimiseks valmistada?
Kirjeldage katset üksikute etappide kaupa.

Sobilikum meetod homoloogide uurimiseks on plasmiidi-vahetamise meetod. Selleks tuleb kloonida tsentromeersed süstik-vektorid:

plasmiid 1 sisaldab S. cerevisiae GEEN X kodeerivat järjestust koos promootor- ja terminaatorjärjestustega ning URA3 selektsioonimarkerit
plasmiid 2 sisaldab S. pombe geenY⁺ kodeerivat järjestust koos S. cerevisiae GEEN X promootor- ja terminaatorjärjestustega ning LEU2 selektsioonimarkerit.
kontrollplasmiid 3 sisaldab S. cerevisaie GEEN X kodeerivat järjestust koos promootor- ja terminaatorjärjestustega ning LEU2 selektsioonimarkerit.

Katses kasutatakse pagaripärmi GEEN X deletsioonitüve (

geenX,

ura3,

leu2), kuhu on sisse transformeeriutd URA3 markergeeniga tsentromeerne plasmiid ning sellelt ekspresseerub GEEN X (plasmiid 1). See on nn. vastuvõttev tüvi.

Katse etapid:

1. Plasmiidi 2 transformatsioon.

Plasmiid 2, mis sialdab LEU2 markergeeni ja S. pombe geenY⁺, transformeeritakse vastuvõtvasse tüvesse. Transformandid selekteeritakse söötmel, millest puuduvad uratsiil ja leutsiin. Saadud pärmitüvi sisaldab nüüd mõlemat plasmiidi.

2. Plasmiidi 1 vastuselektsioon.

Pärmirakud külvatakse 5-fluoro-oroothapet (5-FOA) sisaldavale söötmele. Sellel söötmel kaotavad rakud URA3 markergeeniga plasmiidi.

3. Tulemuste analüüs.

Analüüsitakse rakkude võimet moodustada kolooniaid. Juhul kui rakud jäävad 5-FOA söötmel ellu, siis S. pombe geenY⁺ suudab komplmenteerida GEEN X deletsiooni pagaripärmi genoomis. Tegemist on samasugust funktsiooni omavate geenidega. Kui rakud 5-FOA söötmel kolooniaid ei moodusta siis S. pombe geenY⁺ ei asenda pagaripärmi GEEN X ning nendel geenidel on rakus täita erinevad funktsioonid.

Katses kasutatakse kontrollplasmiididena:

ilma inserdita tsentromeerset plasmiidi, mis sisaldab LEU2 selektsioonimarkerit
kontrollplasmiidi 3 (GEEN X ja LEU2 selektsioonimarker).

Ka nende plasmiididega viiakse läbi plasmiidide vahetamine. Rakud, kes sisaldavad ilma inserdita LEU2 markergeeniga plasmiidi, 5-FOA söötmel surevad, sest GEEN X on eluks hädavajalik. Rakud, kes sisaldavad kontrollplasmiidi 3, peaksid 5-FOA söötmel kasvama, sest GEEN X genoomne deletsioon on komplementeeritud LEU2 selektsioonimarkerit sisaldavalt plasmiidilt.

« Eelmine | Järgmine »