Näide sünteetiliselt letaalsete mutatsioonide sõelumisest
Sünteetiliselt letaalsete mutatsioonide sõelumise näiteks on 2001. a. S.J. Brill ja kaastöötajate poolt avaldatud uurimus (Mullen jt, 2001).
Pagaripärmis ekspresseeruv Sgs1 valk on RecQ perekonda kuuluv DNA helikaas ning on vajalik genoomi stabiilsuse säilitamiseks. SGS1 geen ei ole pärmirakkudele eluks hädavajalik geen. Mutantide leidmiseks, kes vajavad eluks SGS1 metsiktüüpi alleeli, kasutati sünteetiliselt letaalsete mutantide sõelumist.
Algtüvi sisaldas SGS1 deletsiooni (sgs1
) ja ade topeltmutatsiooni (ade2 ade3). See tüvi ei suuda kasvada söötmel, millest puudub adeniin. Moodustuvad kolooniad (ade2 ade3) on valge värvusega, sest ade3 mutatsioon asub adeniini biosünteesi rajas ade2 mutatsioonist eespool. Algtüvesse transformeeriti plasmiid, mis sisaldas SGS1 metsiktüüpi alleeli ning ADE3 ja URA3 markergeene. Moodustuvad kolooniad (ade2 ADE3) on punase värvusega, sest nendes rakkudes peatub adeniini biosünteesi rada ade2 mutatsiooni tõttu ning rakkudesse koguneb punane pigment. Plasmiidi kadumisel tekivad sektoriga kolooniad. Rakud, kes plasmiidi kaotavad on ade2 ade3 ning valget värvi. Rakud, kes sisaldavad plasmiidi on ade2 ADE3 ning punast värvi.
) ja ade topeltmutatsiooni (ade2 ade3). See tüvi ei suuda kasvada söötmel, millest puudub adeniin. Moodustuvad kolooniad (ade2 ade3) on valge värvusega, sest ade3 mutatsioon asub adeniini biosünteesi rajas ade2 mutatsioonist eespool. Algtüvesse transformeeriti plasmiid, mis sisaldas SGS1 metsiktüüpi alleeli ning ADE3 ja URA3 markergeene. Moodustuvad kolooniad (ade2 ADE3) on punase värvusega, sest nendes rakkudes peatub adeniini biosünteesi rada ade2 mutatsiooni tõttu ning rakkudesse koguneb punane pigment. Plasmiidi kadumisel tekivad sektoriga kolooniad. Rakud, kes plasmiidi kaotavad on ade2 ade3 ning valget värvi. Rakud, kes sisaldavad plasmiidi on ade2 ADE3 ning punast värvi.
Viidi läbi mutagenees ning otsiti kolooniaid, kes selektsiooni kadumisel ei moodusta puna-valge sektoriga kolooniaid (st. nad ei talu plasmiidi kadumist ning on punast värvi). Plasmiidi hädavajalikkust analüüsiti 5-fluoro-oroothapet (5-FOA) sisaldaval söötmel. Juhul kui genoomi on tekkinud teine mutatsioon, mis on sünteetiliselt letaalne sgs1, siis need rakud vajavad ellujäämiseks plasmiidilt ekspresseeruvat SGS1 metsiktüüpi alleeli. 5-FOA-d sisaldaval söötmel kaob rakkudest plasmiid ning need mutandid surevad.
, siis need rakud vajavad ellujäämiseks plasmiidilt ekspresseeruvat SGS1 metsiktüüpi alleeli. 5-FOA-d sisaldaval söötmel kaob rakkudest plasmiid ning need mutandid surevad.
Sõelumise tulemusena isoleeriti kuus mutanti (slx1-6). Metsiktüüpi SLX geenide kloonimiseks kasutati plasmiidi vahetamise meetodit. Topeltmutatsiooniga tüvedesse (sisaldasid sgs1 ja slx mutatsioone ning plasmiidi geenidega SGS1, URA3, ADE3) transformeeriti LEU2 markergeeniga plasmiidne raamatukogu. Transformandid külvati 5-FOA-d sisaldavale söötmele ning isoleeriti kolooniad, kes ei vajanud ellujäämiseks SGS1 ekspresseerivat plasmiidi. Need rakud sisaldasid LEU2 markergeeniga plasmiidi, millelt ekspresseerus kas metsiktüüpi SGS1 või metsiktüüpi SLX geen. SGS1 ekspressiooniplasmiidid eristusid selle poolest, et nad olid võimelised komplementeerima kõigi kuue sgs1 slx mutandi sünteetilist letaalsust. Isoleeritud SLX ekspresseerivad plasmiidid võimaldasid kindlaks teha geenid ning uurida täpsemalt nende funktsioone.
ja slx mutatsioone ning plasmiidi geenidega SGS1, URA3, ADE3) transformeeriti LEU2 markergeeniga plasmiidne raamatukogu. Transformandid külvati 5-FOA-d sisaldavale söötmele ning isoleeriti kolooniad, kes ei vajanud ellujäämiseks SGS1 ekspresseerivat plasmiidi. Need rakud sisaldasid LEU2 markergeeniga plasmiidi, millelt ekspresseerus kas metsiktüüpi SGS1 või metsiktüüpi SLX geen. SGS1 ekspressiooniplasmiidid eristusid selle poolest, et nad olid võimelised komplementeerima kõigi kuue sgs1 slx mutandi sünteetilist letaalsust. Isoleeritud SLX ekspresseerivad plasmiidid võimaldasid kindlaks teha geenid ning uurida täpsemalt nende funktsioone.