Browsing by Author "Kipper, Kalle"

Filter results by typing the first few letters
Now showing 1 - 3 of 3
  • Thumbnail Image
    Item
    RNA Granules in Human Neuroblastoma Cell Line SH-SY5Y
    (2020) Astapenka, Artur; Pulk, Arto; Kipper, Kalle
    We aimed to establish a protocol for the purification of neuronal RNA granules from all-trans retinoic acid differentiated human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Different bio-chemical purification methods were tested for obtaining a homogenous preparation of RNA granules for later structural analysis by cross-linking coupled mass-spectrometry or single-particle cryo-electron microscopy. The major problem encountered was a significant amount of copurifying cellular glycogen granules in the RNA granule preparations obtained by a combination of velocity sedimentation and size-exclusion chromatography. However, a ma-jority of the contaminating glycogen could be removed from the RNA granule preparations using a maltose-binding protein (MBP) or artificial FLX protein based Ni-Sepharose or Flag-resin affinity chromatography. Besides, changes in the expression levels of mRNAs im-portant for neuronal differentiation and synaptic function upon SH-SY5Y differentiation were analyzed. A western blot analysis revealed the presence of key RNA granule compo-nents previously identified in rat cortical RNA granules (e.g. CAPRIN-1, G3BP-1, and G3BP-2) in the SH-SY5Y derived RNA granules. In estonian: Käesoleva bakalaureusetöö eesmärgiks oli välja töötada meetodid inimese luuüdikasvajast pärit SH-SY5Y rakuliini kasutamiseks in vitro mudelsüsteemina neuronaalsete RNA graanulite ekspressiooniks ja puhastamiseks. Töö käigus testiti erinevaid biokeemilise puhastamise meetodeid võimalikult homogeense RNA graanulite preparatsiooni valmistamiseks retinoolhappe toimel differentseeritud SH-SY5Y rakkudest hilisemaks RNA graanulite struktuuri analüüsiks ristsidumise massispektromeetria või krüo- elektronmikroskoopia abil. Peamiseks raskuseks osutus töös glükogeeni graanulite kaasapuhastumine RNA graanulitega. RNA graanulite esialgse preparaadi täiendav puhastamine maltoosi siduva valgu või tehisvalgu FLX afiinsusresinil (Ni-sefaroos või Flag, vastavalt) võimaldas siiski kontamineerivat glükogeeni edukalt eemaldada. Töö käigus analüüsiti lisaks retinoolhappe poolt indutseeritud differentseerumisega kaasnevaid muutusi neuronaalsete mRNA-de ekspressioonitasemes SH-SY5Y rakkudes. Western blot analüüs tuvastas roti ajukoorest eraldatud RNA graanulitele omaste oluliste RNA graanuli funktsiooni regulerivate valkude nagu Caprin-1, G3BP-1 ja G3BP-2 olemasolu SH-SY5Y rakkudest eraldatud RNA graanulites.
  • Thumbnail Image
    Item
    Studies on the role of helix 69 of 23S rRNA in the factor-dependent stages of translation initiation, elongation, and termination
    (2011-04-12) Kipper, Kalle;
    Käesoleva doktoritöö eesmärgiks oli selgitada i) ribosomaalse 23S rRNA heeliksi 69 võimalikku rolli valgusünteesi faktorkatalüüsitud etappides ning ii) heeliksis 69 sisalduvate pseudouridiinide rolli translatsiooni terminatsioonil. Lisaks on töös selgitatud ka pseudouridiini süntaasi RluD substraadispetsiifilisust määravaid tegureid. Doktoritöö alguseks oli kogunenud märkimisväärne hulk struktuuripõhiseid viiteid heeliksi 69 osaluses kohta erinevates ribosoomi töötsükli osades. Käesoleva doktoritöö eesmärgiks oligi nende struktuuripõhiste hüpoteeside biokeemiline kontrollimine. Töö eksperimentaalses osas asendati suunatud mutageneesi abil heeliksi 69 valitud positsioonides olevad natiivsed lämmastikalused teiste lämmastikalustega. Variantsed ribosoomid ekspresseeritid E.colis, affiinsuspuhastati ning nende ribosoomide aktiivsust analüüsiti erinevates in vitro katsesüsteemides. Katsetest saadud tulemused osutavad, et 23S rRNA heeliks 69 osaleb initsiatsioonifaktorite aktiivsuse regulatsioonis 70S initsiatsioonikompleksi moodustumisel ning et heeliks 69 on oluline ribosoomi üleminekul initsiatsioonifaasist protsessiivse elongatsiooni faasi. Pseudouridiinide eemaldamine heeliksist 69 pärssis peptiidi vabastamist polüpeptiidi vabanemisfaktori RF2 poolt, kuid ei mõjutanud RF2-ga struktuurilt väga sarnase vabanemisfaktori RF1 aktiivsust. See tulemus osutab erinevustele RF1 ja RF2 katalüüsimehhanismis. Lisaks osutavad meie tulemused, et pseudouridiini süntaasi RluD spetsiifikat heeliksi 69 suhtes suunab heeliksi 69 positsioonis 1916 asuv nukleotiid.
  • Thumbnail Image
    Item
    Trichoderma reesei tsellobiohüdrolaas Cel7A protsessiivsus tselluloosi hüdrolüüsil
    (2005) Kipper, Kalle; Väljamäe, Priit, juhendaja