Browsing by Author "Nonga, Olivier Etebe"
Now showing 1 - 1 of 1
Results Per Page
Sort Options
Item Inhibitors and photoluminescent probes for in vitro studies on protein kinases PKA and PIM(2021-11-03) Nonga, Olivier Etebe; Uri, Asko, juhendaja; Enkvist, Erki, juhendaja; Tartu Ülikool. Loodus- ja täppisteaduste valdkondProteiinkinaasid (PK-d) katalüüsivad valkude fosforüülimist. PK-de ebanormaalne aktiivsus rakkudes on korrelatsioonis keeruliste haigustega. Seetõttu teeb farmaatsiatööstus märkimisväärseid jõupingutusi, et reguleerida PK-de aktiivsust inhibiitoritega ja jälgida nende aktiivsust luminestsents-sondidega. Käesolevas töös kasutatud ARC-inhibiitorid on keemiliselt struktuurilt adenosiini matkivate heteroaromaatsete fragmentide ja peptiidide analoogide konjugaadid, neid ühendeid on pikemalt uuritud Tartu Ülikooli keemia instituudis. Käesolevas uuringus näidati, et PK PKA katalüütilise alaühiku α-isovormi (PKAcα) monoklonaalse antikeha (kloon D38C6) seondumine sihtvalguga on konkurentne ARC-Lum(Fluo) sondiga ja see antikeha inhibeerib substraadi fosforüülimist. Proovi järjestikust töötlemist nende konkureerivate PKAcα ligandidega kasutati tundliku AbARC immuunanalüüsi-meetodi väljatöötamiseks, mis võimaldas määrata väikseid koguseid (alates 93 pg) PKAcα rakulüsaatides. Hiljuti avastati Cushingi sündroomiga patsiendil S54L mutatsiooniga PRKACB geen. See mutatsioon viib PK glütsiinirikka aasa struktuuri muutumiseni. Käesolevas uuringus konstrueeriti muteerunud PK suhtes kuuekordse selektiivsusega inhibiitor. Lisaks töötati välja luminestsents-meetod PKAcβ-valgu kaubanduslike ja väljatöötatud inhibiitorite afiinsuse määramiseks. Koostöös Oxfordi ülikooliga viidi läbi ARC-inhibiitorite ja proteiinkinaasi PIM-1 komplekside röntgenstruktuuranalüüs. Saadud struktuurimudelitest lähtuvalt konstrueeriti lihtsustatud keemilise ehitusega ained. Uued inhibiitorid derivatiseeriti biotiiniga või fluorestsentsvärviga Cy5 ja neid aineid kasutati PIM-kinaasidetuvastamiseks biokeemilistes lahustes ja bioloogilistes proovides. Analüüsimeetod, milles kasutati ARC-sonde koos PIM-2-selektiivse antikehaga , võimaldas määrata sihtvalgu väikseid koguseid (alates 44 pg PIM-2). Konfokaalmikroskoopia abil tuvastati, et uued fluorestsents-sondid tungivad kiiresti U2OS-rakkudesse, kus nende paiknemine kattub PIM-1 ja fluorestsentsvalgu konjugaadi paiknemisega.