Browsing by Author "Pulk, Arto"

Now showing 1 - 3 of 3

Escherichia coli 16S rRNA positsioonid, mis mängivad olulist rolli 70S ribosoomi assotsiatsioonis
(2005) Pulk, Arto; Remme, Jaanus, juhendaja
RNA Granules in Human Neuroblastoma Cell Line SH-SY5Y
(2020) Astapenka, Artur; Pulk, Arto; Kipper, Kalle
We aimed to establish a protocol for the purification of neuronal RNA granules from all-trans retinoic acid differentiated human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Different bio-chemical purification methods were tested for obtaining a homogenous preparation of RNA granules for later structural analysis by cross-linking coupled mass-spectrometry or single-particle cryo-electron microscopy. The major problem encountered was a significant amount of copurifying cellular glycogen granules in the RNA granule preparations obtained by a combination of velocity sedimentation and size-exclusion chromatography. However, a ma-jority of the contaminating glycogen could be removed from the RNA granule preparations using a maltose-binding protein (MBP) or artificial FLX protein based Ni-Sepharose or Flag-resin affinity chromatography. Besides, changes in the expression levels of mRNAs im-portant for neuronal differentiation and synaptic function upon SH-SY5Y differentiation were analyzed. A western blot analysis revealed the presence of key RNA granule compo-nents previously identified in rat cortical RNA granules (e.g. CAPRIN-1, G3BP-1, and G3BP-2) in the SH-SY5Y derived RNA granules. In estonian: Käesoleva bakalaureusetöö eesmärgiks oli välja töötada meetodid inimese luuüdikasvajast pärit SH-SY5Y rakuliini kasutamiseks in vitro mudelsüsteemina neuronaalsete RNA graanulite ekspressiooniks ja puhastamiseks. Töö käigus testiti erinevaid biokeemilise puhastamise meetodeid võimalikult homogeense RNA graanulite preparatsiooni valmistamiseks retinoolhappe toimel differentseeritud SH-SY5Y rakkudest hilisemaks RNA graanulite struktuuri analüüsiks ristsidumise massispektromeetria või krüo- elektronmikroskoopia abil. Peamiseks raskuseks osutus töös glükogeeni graanulite kaasapuhastumine RNA graanulitega. RNA graanulite esialgse preparaadi täiendav puhastamine maltoosi siduva valgu või tehisvalgu FLX afiinsusresinil (Ni-sefaroos või Flag, vastavalt) võimaldas siiski kontamineerivat glükogeeni edukalt eemaldada. Töö käigus analüüsiti lisaks retinoolhappe poolt indutseeritud differentseerumisega kaasnevaid muutusi neuronaalsete mRNA-de ekspressioonitasemes SH-SY5Y rakkudes. Western blot analüüs tuvastas roti ajukoorest eraldatud RNA graanulitele omaste oluliste RNA graanuli funktsiooni regulerivate valkude nagu Caprin-1, G3BP-1 ja G3BP-2 olemasolu SH-SY5Y rakkudest eraldatud RNA graanulites.
Studies on bacterial ribosomes by chemical modification approaches
(2010-07-29) Pulk, Arto
Ribosoom on suur makromolekulaarne kompleks, mis kodeerib päriliku informatsiooni valgulisse olemusse. Eeltuumsete organsimide ribosoom koosneb kaheks alamühikust, väikesest (30S) ja suurest (50S) alamühikust. Ribosoomi kahte alamühikut hoiavad koos ~ 30 erinevat ühendust, mis on jagatud 12 silla (B1a-B8) vahel. Väike alamühik koosneb ühest RNA molekulist (16S rRNA, 1542 nukleotiidi) ja 21-st ribosoomi valgust (S1-S21). Ribosoomi suur alamühik koosneb kahest RNA molekulist (5S rRNA, 120 nukleotiidi ja 23S rRNA, 2904 nukleotiidi) ja 33-st ribosoomi valgust (L1-L36). Minu töös uuritakse ribosomaalse RNA keemiliste positsioonide olulisust ribosoomi kahe alamühiku omavahelisel seonumisel. Keemilise modifitseerimise meetodit kasutades detekteerisime 16S rRNA-s kuus positsiooni (A702, A1418, A1483, U793, U1414 ja U1495), millede modifitseerimine takistab alamühikute assotseerumist. Detekteeritud positsioonid paiknevad tuntud alamühikute vahelistes sildades. Seega alamühikute assotsiatsioonil mängivad olulist rolli sillad B2a (U1495), B2b(U793), B3 (A1418, A1483, U1414) ja B7a (A702). Lisaks sellele töötasime välja meetodi, millega saab uurida RNA suhkur-fosfaat selgroo interaktsioone 23S rRNA-s. Välja töötatud meetodit on võimalik kasutada RNA suhkur-fosfaat selgroo interaktsioonide uurimiseks, substraatide sidumiskohtade määramiseks ja individuaalsete positsioonide mõju määramiseks valgusünteesi erinevates etappides. Kolmandas töös uuritakse ribosoomi valkude võimet välja vahetuda ja selle tulemusena taastada keemiliselt kahjustatud ribosoomide funktsioon. Ribosoomis välja vahetuvate valkude kindlaks tegemiseks, me kasutasime kahte in vitro meetodit, nii radioaktiivset märgistamist kui ka raskete isotoopide eristamise meetodit. Ribosoomi valgud S2, L1, L7/12, L9, L10, L11 ja L33 on kõige kergemini vahetuvad r-valgud. Seega, meie tulemused näitavad, et kahjustatud ribosoome on võimalik parandada valkude asendamise teel.