Sirvi Autor "Vaasa, Angela" järgi

Nüüd näidatakse 1 - 2 2

Development of fluorescence-based kinetic and binding assays for characterization of protein kinases and their inhibitors
(2010-07-29) Vaasa, Angela
Proteiinkinaaside (PK-de) poolt katalüüsitav valkude fosforüleerimine on üks tähtsamaid valkude aktiivsuse reguleerimise mehhanisme, mis võimaldab rakkudel reageerida väliskeskkonna muutustele ning suunata elutegevuse tagamiseks olulisi rakusiseseid protsesse. PK-de funktsioneerimishäiretega (eelkõige nende üleekspressiooni ning anomaalselt kõrge aktiivsususega) on seotud mitmed haigused, sealhulgas vähkkasvajad, suhkruhaigus ja Alzheimeri tõbi. Seetõttu on PK-de uurimine ja PK-de aktiivsust blokeerivate inhibiitorite arendamine muutunud oluliseks nii teadusasutustes kui ka ravimitööstustes. Käesoleva töö raames töötati välja fluorestentsi mõõtmisel põhinevad meetodid kinaaside aktiivsuse määramiseks ning kinaaside inhibiitorite iseloomustamiseks, mille rakendatavust demonstreeriti nii kinaase sisaldavates lahustes kui ka elusrakkudes. Esimene arendatud meetod põhineb fluorestsentsmärgistatud cAMP-sõltuva proteiinkinaasi (PKA) substraadi (5-TAMRA-kemptiid) lahutamisel fosforüleeritud produktist planaarkromatograafiliselt ning fosforüleerimisreaktsiooni komponentide kvantifitseerimisel fluorestsentsskänneriga. Antud meetodit rakendati edukalt inhibiitorite, sealhulgas ARC-tüüpi inhibiitorite, iseloomustamiseks. Teine meetod on fluorestentsanisotroopia mõõtmisel põhinev sidumismeetod, mis kasutab fluorestsentsvärviga märgistatud adenosiini analoogi ja arginiini-rikka peptiidi konjugaate, ARC-Photo sonde. Uudseid fluorestsentssonde kasutati kinaaside PKAc ja ROCKII inhibiitorite tuvastamiseks ning sidumisomaduste määramiseks. Tõestati ARC-Photo sondide bisubstraatne iseloom ning nende sobivus kinaaside aktiivsuse määramiseks ning rakendatavus sensorina cAMP kontsentratsiooni mõõtmisel. Järgmiseks sammuks oli sidumismeetodi ülekandmine elusrakkudesse, kuna just elusraku keskkond võimaldab adekvaatselt hinnata inhibiitorite omadusi ning proteiinkinaaside inhibeerimisest tingitud füsioloogilisi efekte. Näidati, et ARC-Photo sondid on võimelised läbima raku plasmamembraani. Sealjuures sõltus sondide võime rakku tungida ja nende lokalisatsioon rakus arginiinide arvust ARC-i peptiidses osas, ühendi kontsentratsioonist ning fluorestsentsvärvi keemilisest loomusest. ARC-Photo sondide struktuuride optimeerimine võimaldas välja töötada Försteri resonantsienergia ülekande (FRET) efektiivsuse mõõtmisel põhineva meetodi PKA aktiivsuse jälgimiseks elusrakkudes.
Fluorometric assays for characterization of protein kinase inhibitors
(2006) Vaasa, Angela; Uri, Asko, 1953-, juhendaja; Viht, Kaido, juhendaja