Sirvi Kuupäev , alustades "2013-02-18" järgi

Filtreeri tulemusi aasta või kuu järgi

Nüüd näidatakse 1 - 1 1

Studies on the substrate specificity and multisite phosphorylation mechanisms
(2013-02-18) Kõivomägi, Mardo
Raku jagunemistsükkel ehk rakutsükkel on protsess, mille käigus rakk kahekordistab oma sisu ja seejärel jaguneb kaheks. Rakutsükli saab jagada neljaks erinevaks etapiks: G1-, S-, G2- ja M-faasiks. Võtmetähtsusega sündmused – DNA replikatsioon ja kromosoomide segregatsioon ning järgnev tsütoplasma jagunemine ̶ toimuvad vastavalt S- ja M-faasis. S- ja M-faas on teineteisest eraldatud vaheetappide ehk G1- ja G2-faasiga. Rakutsükli faaside vaheldumine on reguleeritud kontrollsüsteemi poolt, mille peamisteks komponentideks on tsükliinist sõltuvad kinaasid (cyclin-dependent kinase; CDK). CDK valkude aktiivsuse ostsillatsioon sõltub erinevate regulatoorsete subühikute ehk tsükliinide olemasolust erinevates rakutsükli etappides. Tsükliinid võib jaotada kolme klassi: G1-tsükliinid, mis seonduvad CDK-dega G1-faasis, S-faasi tsükliinid, mis kontrollivad DNA replikatsiooni, ja mitootilised ehk B-tüüpi tsükliinid, mis aktiveerivad CDK-d rakutsükli G2- ja M-faasis. CDK-de ensümaatilist aktiivsus reguleeritakse nelja erineva mehhanismi abil: tsükliini seondumine, aktiveeriv või inhibeeriv fosforüleerimine ja seondumine inhibiitorvalkudega. Aktiivsed tsükliin-Cdk kompleksid toimivad lülititena, lisades teistele valkudele fosfaatrühmi ning muutes seeläbi nende omadusi. Enamus substraatvalke sisaldavad mitmeid CDK poolt äratuntavaid fosforüleerimise konsensusjärjestusi S/T-P-x-K/R (kus x võibolla ükskõik milline aminohape), milles aminohapped seriin (S) või treoniin (T) käituvad fosfaadi aktseptorina. Lisaks kuulub tsükliin-Cdk kompleksi veel CDK adaptorvalk Cks, moodustades kolmikkompleksi tsükliin-Cdk-Cks. Cks võib seonduda juba fosforüleeritud valkudega, aidates kaasa substraatide multi-fosforüleerimisele. Üldiselt määravad tsükliin-Cdk-Cks komplekside substraadi spetsiifilisust kolm äratundmismotiivi: 1) Tsükliinil asuv hüdrofoobne tasku, mis interakteerub substraatidel oleva seondumismotiiviga, 2) CDK aktiivsait, mis seondub sihtmärkvalgu konsensusjärjestusega ja 3) Cks-e katioonne tasku, mis seondub juba fosforüleeritud sihtmärkvalkude fosfaatrühma ja ümbritseva konsensusjärjestusega. Üheks mudelorganismiks, kus rakutsükli toimimismehhanisme uurida, on pagari¬pärm Saccharomyces cerevisiae. Erinevalt imetajatest leidub S. cere¬visieae-s ainult üks tsükliinist sõltuv kinaas, Cdk1, mis interakteerub erinevatel rakutsükli etappidel üheksa erineva tükliiniga (Cln1–3 ja Clb1–6) ning adaptor¬valgu Cks1-ga. Tsükliinid Cln1-3 on aktiivsed G1 faasis ja G1/S faasi üle¬minekul. Clb5 ja 6 vastutavad korrektse S-faasi sisenemise ja läbimise eest. Clb3 ja Clb4 osalevad G2/M üleminekul. Clb1 ja Clb2 aga kontrollivad mitoo¬tiliste rakkude saatust. Käesoleva eksperimentaalse töö esimene osa keskendub küsimusele, kuidas muutub erinevate tsükliin-Cdk1 komplekside aktiivsus S. cerevisiae rakutsükli käigus. Kuna enamus CDK sihtmärkvalkudest sisaldavad mitmeid fosforüleerimisjärjestusi, siis keskendusime eksperimentaalse töö teises osas multifosforüleerimise mehhanismi detailsele uurimisele CDK inhibiitorvalgu Sic1-e näitel. B-tüüpi tsükliinide Clb-Cdk1 komplekside inhibiitori Sic1-e tase hakkab tõusma mitoosi lõpus ja valk püsib aktiivsena hilise G1 faasini, kus toimub Sic1-e fosforüleerimisest sõltuv lagundamine. Spetsiifilistest lagundamisjärjestustest ehk degronitest fosforüleeritud Sic1 ära tundmine toimub läbi Cdc4, mis on ubikuitiini ligaasi SCF-i (Skp1/Cdc53/F-box) spetsiifilisusfaktor. Ubikuitineeritud Sic1-e lagundamine toimub üle proteasoomi raja. Oma töös uurisime põhjalikult erinevate tsükliin-Cdk1 komplekside poolt läbiviidavat Sic1 fosforüleerimist. Eksperimentaalse töö kolmandas osas uurisime erinevaid parameetreid, mis mõjutavad Cdk1 poolt läbiviidavat substraatvalkude multifosforüleerimist. Elemendid, mis määravad tsükliin-Cdk1-Cks1-st sõltuva multifosforüleerimise on järgmised: distantsid erinevate fosforüleerimisjärjestuste vahel, tsükliini seodumisjärjestuste positsioon fosforüleerimissaitide suhtes, Cks1 konsensusjärjestuse erinev spetsiifika, seriini- ja treoniinijääkide esinemise suhe CDK konsensusjärjestustes ja iga fosforüleerimisetapi protsessiivsusfaktor.