L-Phenylalanine Biosensor in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

In English: In vivo biosensors can be used for the detection of intracellular and extracellular stimuli leading to a reporter molecule response. Biosensors are becoming increasingly popular in synthetic biology and metabolic engineering for implementation in synthetic pathways to control the expression of reporter genes in response to specific metabolites or external tors. In vivo biosensors are generally divided into three categories: transcription-based, translation-based and post-translational biosensors. L-phenylalanine is one of the most demanded amino acids and it faces an increasing commercial interest since it is a precursor metabolite for flavonoids and other chemicals including the artificial sweetener aspartame, vanillin, aromadedrin, rutin and many others. Therefore, it is of interest in various tries such as pharmaceutical, cosmetic and biotechnology. L-phenylalanine is one of the aromatic amino acids yielded from the Shikimate pathway, also including tyrosine and tryptophan. In this paper the author constructed a transcription factor-based Lphenylalanine biosensor in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The newly constructed strain has two genetic constructs integrated into its genome. First construct uses tional regulatory protein TyrR which forms a dimer only in the presence of Lphenylalanine. The dimer later binds to a TYR strong box sequence in the CYC1p_T1 promoter region of the second construct initiating green fluorescent protein production resulting in a fluorescent signal. Eesti keeles: In vivo biosensoreid võimaldavad detekteerida kindlaid rakusiseseid või -väliseid stiimuleid ning reageerida neile mõne soovitud molekulaarse vastusega. Biosensorite kasutamine on tänu sünteetilise bioloogia ning metaboolse inseneerimise metoodikate arengule pidevalt kasvanud, sest võimaldab kontrollida ning reguleerida soovitud valkude või metaboliitide tasemeid rakus. In vivo biosensorid jagatakse tavaliselt kolmeks: (i) transkriptsiooni-põhised, (ii) translatsiooni-põhised ning (iii) translatsiooni-järgsed biosensorid. L-fenüülalaniin on aminohape ning prekursor-molekul näiteks flavanoididele – keemiliste elementide grupile, kuhu kuuluvad ka kunstlik magusaine aspartaam, vaniliin, aromadedriin, rutiin ning paljud teised kemikaalid. Seetõttu on sel molekulile suur kommertsiaalne huvi nii farmaatsias, kosmeetika-tööstuses kui biotehnoloogias. Lfenüülalaniini biosünteesitakse Sikimaadi rajas, mis toodab ka teisi aromaatseid aminohappeid nagu türosiin ja trüptofaan. Käesolevas lõputöös kirjeldatakse transkriptsioonifaktori meetodil põhinevat L-fenüülalaniini biosensori konstrueerimist pärmis Saccharomyces cerevisiae. Uudset biosensorit sisaldava pärmi tüve genoomi on lisatud kaks uut kostrukti. Esimene konstrukt kasutab transkriptsiooni regulaator-valku TyrR, mis moodustab dimeerse kompleksi vaid L-fenüülalaniini juuresolekul. Dimeerne TyrR kompleks on aga võimaline seonduma TYR ‟strong box‟ järjestusega CYCp_T1 promootor-regioonis teise kontruktiga, mis seejärel initsieerib rohelise floresentsvalgu sünteesi, mis ongi disainitud biosensori väljund-signaal.