Development of a dedicated Golden Gate assembly platform for the non-conventional yeast Rhodotorula toruloides

Abstract

In this study, Golden Gate assembly platform was adapted to develop an efficient assembly system for the nonconventional yeast Rhodotorula toruloides. The DNA fragments were assembled with predesigned 4-nt overhangs, building three transcriptional units, a selection marker, and insertional units for genome targeting. The platform was validated by deleting the KU70 gene, increasing the genome integration efficiency, and by overexpressing the carotenoid production pathway. The total carotenoids increased by 210%. The dedicated GGA platform fills a gap in the advanced genome engineering toolkit of R. toruloides, en-abling efficient design of complex metabolic pathways. In estonian: Rhodotorula toluroides on mittetraditsiooniline õlirikas pärm, millel on hea potentsiaal saada üheks peamiseks rakuvabrikuks lignocelluloosete suhkrute konverteerimisel kõrgema väärtusega kemikaalideks. Antud uuringus kohandati Golden Gate'i (GGA) geneetilise modifitseerimise platvormi esmakordselt just R. toruloides jaoks. Antud metoodikas seotakse DNA fragmendid, kasutades eelnevalt disainitud 4-nt pikkuseid üleulatuvaid DNA järjestusi. Nii konstrueeriti kolm transkriptsiooniühikut, selektsioonimarker ja sisestusühikud genoomi sihtimiseks. Platvorm valideeriti KU70 geeni kustutamise, genoomi integreerimise efektiivsuse suurendamise ja karotenoidide tootmisraja üleekspresseerimise kaudu. Karotenoidide tootmine suurenes seeläbi 210%. Spetsiaalne GGA platvorm täidab lünga R. toruloides'i geenitehnoloogia tööriistakomplektis, võimaldades keeruliste metaboolsete radade tõhusamat disainimist ja genoomi integreerimist.