Pagaripärmi cdc mutandid
Pagarpärmi Saccharomyces cerevisiae rakutsüklit
iseloomustab punga teke kindlas rakutsükli faasis. Pagaripärmi rakkudel moodustub pung S-faasi (DNA replikatsioon) alguses. Pung kasvab kuni
M-faasini (mitoos ehk tuumajagunemine).
Leland Hartwell ja Brian Reid
märkasid, et raku morfoloogia järgi saab määratleda millises rakutsükli
faasis antud rakk on. Väikesed rakud, kellel ei ole veel moodustunud punga, on
varases G1 faasis. Pungata suured rakud on G1 faasi lõpus.
Väikese punga olemasolu näitab, et rakud on alustanud DNA replikatsiooniga. Suure pungaga rakud paiknevad G2 ja M
faasides.
Hartwell ja kaastöötajad otsisid pagaripärmi mutante, kellel oleks defekt makromolekulide sünteesis, st. rakud ei suuda transleerida valke, transkribeerida RNA-d või replitseerida DNA-d. Nad viisid läbi ülegenoomse mutageneesi ja isoleerisid temperatuuritundlikud cdc ("cell division cycle") mutandid (Joonis 8). Saadud mutantide fenotüübid kirjeldati lubatud temperatuuril (25 oC) ja piiraval temperatuuril (36 oC). Punga olemasolu ja suurust kasutati tunnusena, et määrata millises rakutsükli faas mutandid peatuvad.
Joonis 8. cdc temperatuurtundlike mutantide isoleerimine.
1970. a. avaldatud artiklis kirjeldasid Hartwell ja kaastöötajad 100 temperatuuritundliku mutandi fenotüübid.
Nad kasutasid mutantide iseloomustamiseks fotomikroskoopiat. Analüüsiti rakkude pungumist, DNA sünteesi, tuumajagunemist, tsütokineesi ja rakkude jagunemist 36 oC juures. Leiti, et 15 mutanti peatuvad kindlas rakutsükli faasis. Autorid järeldasid, et see rakutsükli faas määrab koha, millal mutatsiooni sisaldav geen on funktsionaalne. Näiteks, mutandi cdc8 kasvatamisel 36 oC juures tekivad suure pungaga rakud, kus tuum paikneb pungakaelas (Joonis 9). CDC8 kodeerib kinaasi, mis on oluline de novo pürimidiin desoksüribonukleotiidide biosünteesil. Mutatsioon selles geenis põhjustab probleeme DNA replikatsioonil. Mutant cdc24 moodustab 36 oC kasvades nelja tuumaga rakud. CDC24 kodeerib valku, mis on vajalik raku polaarsuse määratlemisel. Mutandid on defektsed punga moodustamises ja paardumisel. Vaatamata sellele toimub DNA replikatsioon ja tuumajagunemine nendes rakkudes sarnaselt metsiktüüpi rakkudele.
Joonis 9. Metsiktüüpi rakkude, cdc8 ja cdc24 fenotüübid 36 oC juures kasvades.
1974. a. avaldatud artiklis Hartwell ja kaastöötajad analüüsisid 150 cdc mutandi fenotüüpe.
Nad defineerisid rakutsüklis nn. Start punkti. See asub hilises
G1 faasis, kus rakud hindavad
kasvukeskkonda ning otsustavad kas läbida raku jagunemise tsükkel või
ei. See on pagarpärmi rakutsüklis üks põhilisemaid regulatsiooni kohti.
Sõltuvalt kasvukeskkonnale võivad Start punktis rakud vastu võtta erinevad otsused:
- kui kasvukeskkonnas on piisavalt toitaineid siis rakud läbivad jagunemise tsükli;
- kui kasvukeskkonnas on vastaspaardumistüüpi omavate rakkude poolt sekreteeritud feromoon, siis; haploidsed peatuvad G1 faasis ja paarduvad;
- kui kasvukeskkonaas on vähe lämmastiku allikat siis diploidsed rakud sporuleeruvad;
- rakud, sattudes nälga, lähevad statsionaarsesse faasi.