Ekspressiooniplasmiidid (YXp)

 
Ekspressiooniplasmiidid (YXp) sisaldavad promootor- ja terminaatorjärjestusi ning neid kasutatakse pärmides valkude ekpresseerimiseks. Nad sisaldavad järgmisi geene ja DNA elemente (Joonis 9):
  • bakteri replikatsiooni alguspunkt - ori
  • bakteri selektsioonimarker - AmpR
  • pärmi selektsioonimarker (URA3, LEU2, TRP1 jne.)
  • polülinker - MCS
  • autonoomselt replitseeruv järjestus pärmi kromosoomist - ARS element
  • tsentromeerne järjestus pärmi kromosoomist - CEN element
  • promootorjärjestus
  • terminaatorjärjestus
Joonis 9. Pärmi ekspressiooniplasmiidi kaart. AmpR, -laktamaasi geen; ori, E. coli replikatsiooni alguspunkt; TRP1, pärmi selektsioonimarker; MCS, polülinker; ARS, pärmi autonoomselt replitseeruv järjestus; CEN, tsentromeerne järjestus; P, promootorjärjestus; T, terminaatorjärjestus.
 
Meid huvitava geeni cDNA, sünteetiline DNA või ilma introniteta genoomne DNA kloonitakse promootorjärjestuse ja terminaatorjärjestuse vahele.
 
Promootorjärjestus sisaldab transkriptsiooni initsiatsiooni järjestust ning lühikest 5'-mittetransleerivat ala. Tavaliselt ei sisalda ekspressioonivektorid ATG koodonit. Seega peab kloonitav järjestus omama ATG-d. On tähtis, et geeni alguses olev ATG oleks esimene ATG järjestus transkribeeritavas mRNA-s, sest pärmis initseeritakse valgu translatsioon tavaliselt esimeselt AUG koodonilt. Kasutades uuritava geeni enda 5'-mittetransleerivat ala peab silmas pidama, et see oleks sarnane pärmis kõrgelt ekspresseeruvate valkude mRNA 5'-mittetransleeriva järjestusega, st. puuduvad sekundaarstruktuurid, järjestus on A-rikas ja G-vaene, A asub -3 positisioonis AUG koodoni suhtes.
 
Pagaripärmis kasutatavaid promootoreid tutvustab õpiojekt: "Pärmigeneetika: pärmitüvede genotüübid, tüvede kasvatamiseks kasutatavd söötmed".
 
Terminaatorjärjestus sisaldab signaale transkriptsiooni terminatsiooniks.
« Eelmine | Järgmine »