Pagaripärmi tüvede ristamine ja sporuleerimine
Pagaripärmi haploidsete tüvede ristamine ja sporuleerimine toimub kahes etapis:
- haploidsete tüvede ristamine ja diploidi eraldamine
- diploidi sporuleerimine
Tüvede ristamiseks segatakse rikka söötmega (YPD) tassil kokku võrdne kogus rakke paardumistüüpidega a ja
. Rakkudel lastakse kasvada ja paarduda 24 tundi ning seejärel eraldatakse tekkinud diploidid.
![](eXe_LaTeX_math_1.1.gif)
Diploidide eraldamiseks saab kasutada kahte erinevat meetodit:
Meetod 1. Kui ristatud haploidsed tüved omavad erinevaid selektsioonimarkereid, siis saab diploidi eraldada neid selektsioonimarkereid kasutades.
Näide: Üks ristamisel kasutatud tüvi on Leu- Ura+ (vajab kasvamiseks söötmes leutsiini), teine tüvi aga Ura- Leu+ (vajab kasvamiseks söötmes uratsiili). Tekkinud diploidid on Leu+ Ura+ fenotüübiga. Kui ristamissegu külvata selektsioonitassile milles puuduvad nii leutsiin kui ka uratsiil, siis sellel tassil kasvavad vaid tekkinud diploidid. Mõlemad haploidid sellel söötmel kasvada ei suuda.
Meetod 2: Diploidsed rakud on haploidsetest rakkudest 1,2 korda suuremad. Seetõttu ka diploidsetest rakkudest koosnevad kolooniad kasvavad suuremaks kui haploidsete rakkude kolooniad. Tekkinud diploidid on võimalik eraldada koloonia suurusi võrreldes.
Näide: Paardumissegu külvatakse joonkülvi kasutades uuele rikka söötmega tassile. Tekkinud kolooniate suurusi võrreldakse 24 tunni möödumisel. Diploidsetest rakkudest koosnevad kolooniad on suuremad kui haploidsetest rakkudest moodustunud kolooniad. Rakkude suuruse erinevus on nähtav ka valgusmikroskoobis.
Diploidide sporuleerimiseks külvatakse rakud sporulatsioonisöötmele. Selles söötmes puudub lämmastiku allikas (tekib lämmastiku nälg) ning süsiniku allikaks kasutatakse mitte-fermenteeritavat süsiniku allikat (näiteks kaalium atsetaat). Sporulatsioon toimub 3-5 päeva jooksul. Tekivad 4 spooriga askused (Joonis 3).
![](ristamine12.jpg)
ruumiliselt, siis on näha kolme neljast spoorist. Kui askusi töödelda ensüümiga
(Zymolyase), mis lõhub osaliselt askuse kesta, siis on 4 spoori askuses hästi nähtavad.
Pagaripärmi spooride saamiseks võib erineva paardumistüübiga tüved lihtsalt
kokku segada ning külvata siis sporulatsioonisöötmele. Seda meetodit kasutades, ei ole spooride tekkimine efektiivne ning seda ei saa kasutada halvasti sporuleeruvate tüvede korral.