Synthesis of aza-β3-amino acid containing peptides and kinetic study of their phosphorylation by protein kinase A

Date

2012-05-18

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Publisher

Abstract

Paljud bioloogiliselt aktiivsed ained kuuluvad peptiidide klassi. Peptiidide kasutamist ravimitena segab aga nende kiire lagunemine elusorganismis seal leiduvate proteaaside toimel. Stabiilsuse suurendamiseks on võimalik keemiliselt modifitseerida peptiidsidemeid ning nii luua peptiidi-taolisi ühendeid, mis on elusrakus stabiilsemad kui tavalised peptiidid. Samas ei tohi selline peptiidi struktuuri muutmine oluliselt mõjutada selle aine bioloogilist toimet, mille põhjustab molekuli selektiivne toime tema märklauaks oleva sidumistsentriga retseptorvalgul või ensüümil. Eeldatakse, et sellise selektiivse sidumise tingimuseks on peptiidimolekuli moodustavate aminohapete külgrühmade struktuuri ja järjestuse molekulaarne äratundmine märklauaks oleva sidumistsentri poolt. Küsimus on seega selles, millised mõjud peptiidi äratundmisele toob kaasa peptiidsideme keemiline modifitseerimine ja millised on erinevate modifitseerimise viiside toimed. Nendele küsimustele vastuse otsimine on käesoleva uurimistöö üldisem eesmärk. Selle saavutamiseks oli aga vajalik mitmete keemiliste probleemide lahendamine, alates peptiidsideme analoogide sünteesist ning lõpetades modifitseeritud peptiidide bioloogilise aktiivsuse uuringutega mudelsüsteemis. Mudelsüsteemina kasutati cAMP-sõltuva proteiinkinaasi katalüütilist alaühikut, mis edukalt toimib peptiididega ning mille jaoks on selles protsessis ilmneva molekulaarse äratundmise mehhanisme põhjalikult uuritud. Lähtudes neist teadmistest sünteesiti selles töös peptiidi RRASVA analoogid, kus igas positsioonis (välja arvatud seriin) vahetati looduslik aminohape aza-3-aminohappe jäägi või siis N-metüleeritud aza-3-aminohappe jäägi vastu. Uuriti ka varianti, kus samas lähtepeptiidis oli asendatud korraga kaks looduslikku aminohapet. Sellisel teel saadi kolm seeriat peptidomimeetilisi proteiinkinaasi substraate, mille toimet selle ensüümi aktiivtsentriga iseloomustati nende fosforüleerimise reaktsiooni kineetika kaudu. Töö tulemuste põhjal võib järeldada, et mitme peptiidahela modifikatsiooni samaaegne olemasolu raskendab oluliselt substraadi molekulaarset äratundmist, samas kui ühe modifikatsiooni olemasolu võimaldab saada loodusliku ühendiga võrreldavaid tulemusi. Töös arutatakse võimalikke põhjuseid, kuidas peptiidsideme modifitseerimine võib mõjutada aminohapete külgrühmade kaudu toimivat aine molekulaarset äratundmist. Tehtud järeldused on olulised järgmiste peptidomimeetikute loomisel, sest võimaldavad teatud määral ette ennustada nende ainete bioaktiivsust.
Many biologically active compounds are peptides. Use of peptides as medicines is impaired by their fast clearance in living organisms as a result of protease action. To increase their stability it is possible to chemically modify peptide bonds thus producing peptide-like compounds which are more stable in living cells than normal peptides. At the same time, such modification should not considerably influence biological activity, which is based on molecule selectivity for its target binding site in receptor protein or enzyme. It is assumed that the necessary condition for such selective binding is side chain pattern recognition by target binding site. The question is what effects does peptide bond chemical modification have on peptide recognition and what are the mechanisms of action of various modification types. Looking for answers to these questions was the general aim of this study. In order to find it it was necessary to solve a few chemical problems, from amino acid analog preparation to modified peptides activity measurements in model system. As model system cAMP-dependent protein kinase A catalytic subunit was used, which efficiently works on peptides and apparent molecular recognition mechanism for which is thoroughly studied. Proceeding from this knowledge peptide RRASVA analogs were prepared, in which amino acid residue in every position (except for phosphorylatable serine) was substituted for aza-β3- or Nβ-methylated aza-β3-amino acid residue. Substrates with two simultaneous aza-β3 substitutions were also studied. This way three protein kinase substrate series were prepared, interaction of which with this enzyme active site was characterized by their phosphorylation reaction kinetics. The results of this study allow to conclude that multiple aza-β3 substitutions in peptide chain greatly complicates the molecular recognition, while single aza-β3- or Nβ-methyl-aza-β3 substitution allows to achieve characteristics similar to those of natural parent compound. The conclusions made are of importance for further peptidomimetic design, as they allow predicting the bioactivity of these compounds.

Description

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsioone.

Keywords

aminohapped, peptiidid, süntees, fosforüülimine, proteiinikinaas A, amino acids, peptides, synthesis, phosphorylation, protein kinase A

Citation