Development and applications of E. coli immunosensor

Abstract

Iga aastaga muutuvad keskkonna kvaliteet ja puhtus maailmas aina olulisemaks. Üks tähtsamaid küsimusi on inimeste ligipääs puhtale veele. Kui tavaliselt mõeldakse selle all eelkõige joogivett, siis sama oluline on ka suplusvee puhtus ja ohutus. Üheks vee kvaliteedi parameetriks on tema mikrobioloogiline ohutus, mille hindamiseks kasutatakse teatud bakteriliike, ehk indikaatorliike, mille olemasolu ja arvukuse järgi hinnatakse vee kvaliteeti. Üheks levinumaks indikaatorliigiks vees on Escherichia coli ehk soolekepike. Mõned E. coli tüved võivad olla ka patogeensed. Tavaliselt hinnatakse E. coli arvukust mikrobioloogilistel meetoditel, kultiveerides proove spetsiaalsetel söötmetel, kuid see on aeganõudev. Molekulaarsed meetodid (PCR) on küll kiiremad, kuid nõuavad keeruka aparatuuri kasutamist ning on tundlikud võimaliku saastuse ja proovide maatriksist tuleneva inhibitsiooni suhtes. Doktoritöö eesmärgiks oli välja töötada immunobiosensorsüsteem E. coli tuvastamiseks ning testida selle biosensori rakendamise võimalusi looduslike veeproovide ja kliiniliste uriiniproovide analüüsil. Kasutatud biosensori bioloogiline äratundmiskomponendina kasutati fluorestsentsmärgisega konjugeeritud anti - E. coli ankeha. Analüüsi kõrge tundlikkus saavutati tänu proovis leiduva E. coli sidumisele ühekordse kasutusega mikrokolonnile ning seondunud bakterite spetsiifilisele detekteerimisele. Erinevatest allikatest pärinevates proovides saadud analüüsitulemusi võrreldi alternatiivsete E. coli määramismeetodite, mikrobioloogilise külvi ja kvantitatiivse PCR abil saadud tulemustega. Nimetatud metoodikad võimaldavad küll kõik hinnata E. coli arvukust, kuid mõõdavad erinevaid rakku iseloomustavaid suurusi. Mikrobioloogiliste külvide meetod võtab arvesse elusaid kultiveeritavid rakke; kvantitatiivne PCR hindab E. coli genoomse DNA kogust (elusad + mitte-kultiveeritavad ja surnud rakud), ning biosensor mõõdab E. coli mebraanivalkude kontsentratsiooni proovis. Mõõtes näiteks ühte ja sama veeproovi kirjeldatud meetoditega selgus, et oodatult kõige madalama tulemuse andis mikrobioloogiline meetod (40 korda madalam, kui biosensor), ning ka qPCR meetod andis keskmiselt 4 korda madalama tulemuse kui biosensor. Töö selgitati välja põhjused, mis selliseid erinevusi põhjustasid. Esiteks, biosensoris põhjustasid mõõdetava signaali ka rakkude mehhaanilisel ja keemilisel töötlemisel saadud rakumembraanide fragmendid. Teise olulise tulemusena selgus, et biosensoris kasutatava antikeha äratundmisreaktsioon oli komplekses mikrobioloogilises keskkonnas eeldatust vähem selektiivne. Lisaks E. coli´le on looduslikes keskkondades palju sarnaseid bakteriliike (kolivormseid), millest mõnedel on potentsiaalselt afiinsus immunosensoris kasutatud E. coli antikeha suhtes. Kuna selliste bakterite üldhulk looduslikes vetes võib olla kõrge, siis tuleb biosensori mõõtetulemuste interpreteerimisel arvestada ka nende poolt genereeritava signaaliga. Arvestades erinevate rakufragmentide ning kolivormsete rakkude poolt põhjustatud signaali osakaalu, siis elusate kultiveeritavate E. coli rakkude poolt tingitud signaali osakaal on immunosensori kogusignaalist 10%. E. coli immunosensorit kasutati ka uropatogeense E. coli tuvastamiseks ja kvantiteerimiseks kliinilistes uriiniproovides, kus biosensoriga saadud analüüsitulemused langesid kokku mikrobioloogiliste ja molekulaarsete (qPCR) meetoditega saadud tulemustega. Väljatöötatud biosensorsüsteem võimaldas määrata E. coli sisalduse vee- või uriiniproovides vahemikus 7-107 rakku milliliitris 20 minuti jooksul, mis loob eelduse E. coli automaatseks kohapealseks määramiseks, vältides vajadust proovide transpordiks laborisse ning analüüsile eelnevaks töötluseks.The quality of water is among the major global problems usually associated with drinking water. However, problems with the physical, chemical, and biological pollution of bathing water are increasing. The biological pollution is commonly assessed using microbiology methods by identifying and quantifying microbial indicator organisms. The most common indicator species for water analysis is Escherichia coli – gram-negative, rod-shaped bacteria generally found in the guts of warm-blooded animals. Most E. coli strains are harmless, but there is also a group of E. coli strains, which are human pathogens Uropathogenic E. coli (UPEC) is the main human urinary tract pathogen. The most common method for E. coli enumeration is still microbiological cultivation. This method is reliable and simple, but the analysis time is long, the sensitivity is quite poor and the cultivation requires special lab conditions. In addition, E. coli can be detected with qPCR. A good alternative for E. coli indication and enumeration are biosensor-based systems, which can provide short analysis time, high specificity, and sensitivity. Biosensors also offer options for automation and on-site analysis required to meet modern requirements for data collection. The objective of this thesis was the design and production of an E. coli-specific immunosensor, its testing for potential applications in environmental monitoring and clinical laboratory analysis, and validation of the biosensor results. The proposed E. coli immunosensor integrates the use of polyclonal E. coli antibodies for bio-recognition and single-use microcolumn analysis system for the rapid detection of E. coli from bathing water and urine samples. The immunosensor the detection limit was below 10 cells/ml, and the working range was between 10…108 cells/ml. In urine, there was no inference other bacterial species present in urine to the biosensor signal, as there is a small probability of the presence of dead and/or fragmented E. coli cells in urine. The E. coli biosensor results were in the same range as those obtained with qPCR and cultivation methods. The analysis of the biosensor signal in bathing water samples revealed that the signal was strongly affected by dead cells, cell fragments, and different coliforms, which are abundant in natural waters. The proportion of cultivable E. coli cells in the immunosensor entire signal was only about 10%. The signal of non-cultivable E. coli cells (measured by qPCR) formed 30% of the immunosensor signal and the majority of the measured signal, 60%, was most likely generated by different forms of coliform bacteria and E. coli cell fragments. Using renewable, single-use E. coli immunosensor is an excellent alternative to time-consuming microbiological and molecular methods for analyzing complex natural samples. These immunosensors can significantly shorten the time required to determine and quantify E. coli. It could be used for automated analyses, as quick identification of E. coli allows to take timely measures to minimize potential health risks.