The application of oligonucleotide hybridization model for PCR and microarray optimization

Abstract

Nukleiinhapped on orgaaniliste makromolekulide hulgas unikaalsed tänu oma võimele kodeerida, dekodeerida ja kanda üle digitaalset informatsiooni. See omadus on aluseks nende kasutamisele arenevates tehnoloogiavaldkondades, alates kliinilisest diagnostikast kuni nanotehnoloogia ja informatsiooni talletamiseni. On aga oluline mõista, et digitaalse informatsiooni töötlemise ja säilitamise aluseks nukleiinhapetes on nende keemilised omadused. Tähtsaim nendest on hübridiseerumine - nukleiinhapete võime moodustada spontaanselt kaheahelaline heeliks kahe komplementaarse või osaliselt komplementaarse üheahelalise molekuli liitumisel. Nukleiinhapete hübridisatsiooni termodünaamika arvestamine võimaldab selle protsessi käitumist suure täpsusega modelleerida ja täiustada paljusid biotehnoloogilisi protsesse. Käesolevas väitekirjas on hübridisatsioonimudelit kasutatud multipleks-PCR-i ja detektsiooni mikrokiipide optimeerimiseks. Me töötasime välja ökonoomse algoritmi jaotamaks PCR praimeripaarid multipleksigruppidesse vastavalt nende omavahelisele sobivusele. Algoritm on realiseeritud nii iseseisva programmi kui veebirakendusena. Me uurisime multipleks PCR ebaõnnestumise põhjuseid ja näitasime, et suur arv mittespetsiifilisi seondumiskohti lähte DNA-l vähendab praimerite töötamise edukust. Need praimeripaarid, millel oli liiga suur arv mittespetsiifilisi seondumisi mitte ainult ei töötanud ise halvasti, vaid vähendasid ka teiste nendega koos amplifiseeritud praimeripaaride õnnestumise tõenäosust. Me töötasime välja arvutiprogrammi genereerimaks täieliku nimekirja kõigist võimalikest bakteriaalse tmRNA hübridiseerimisproovidest mis eristaksid omavahel kahte gruppi organisme. Proovide valideerimise käigus me näitasime, et valides hübridisatsioonienergia läviväärtuse suurema kui 4 kcl/mol on võimalik täielikult vältida valepositiivseid signaale. Me uurisime võimalust suurendada bakteriaalse RNA hübridiseerumiskiirust lisades lühikesi spetsiifilisi oligonukleotiide, mis hübridiseerudes lähtemolekulile ei lase selle sekundaarstruktuuril moodustuda. Seda meetodit kasutades tõusis hübridiseerumiskiirus temperatuuril 37C neli korda.

Nucleic acids are unique among all organic macromolecules by the ability to encode, decode and transmit digital information. This property is used in emergent technologies as diverse as medical diagnosis, nanoscale engineering and information storage. Still it is important to understand that the basis of this digital information processing are the chemical properties of nucleic acids, the most important being the spontaneous formation of double-stranded helix between complementary or semi-complementary single-stranded molecules, called hybridization. Taking into account the thermodynamic properties of nucleic acid hybridization allows researchers to model the process with great accuracy and thus improve many associated technologies. In current thesis the hybridization model is used to optimize multiplex PCR and microarray hybridization. We developed an efficient algorithm to distribute PCR primer pairs into multiplex groups based on their compatibility with each other. The algorithm is also implemented as both standalone and web-based computer program. We analyzed the probable causes of failure of multiplex PCR and demonstrated that the large number of nonspecific hybridization sites in template DNA is detrimental to PCR quality. Primer pairs with too many nonspecific hybridization sites not only worked poorly but caused the failure of other primer pairs as well. We developed a computer program to generate exhaustive list of all possible hybridization probes for the detection of bacterial tmRNA, capable of distinguishing between two groups of source RNA. The probes were evaluated on microarray and shown that by keeping the hybridization energy cutoff between target and non-target groups over 4 kcal/mol all false-positive signals were eliminated. We analyzed the possibility of increasing the hybridization speed of bacterial tmRNA on low temperatures by applying short specific oligonucleotides that selectively hybridize with template molecules and break their secondary structure. Using this method the hybridization speed was increased fourfold at 37C.