Design, functionlization and application of an in situ synthesized oligonucleotide microarray

Abstract

In molecular diagnostics, microarray-based assays enable the flexible identification of disease-associated SNPs, mutations (including indels), gene copy numbers, viruses, and other pathogens. These assays are usually quite robust, highly parallel, and are increasingly used in diagnostics laboratories. With the photolithographic maskless synthesis of oligonucleotide microarrays assisted by micromirrors (i.e., as are used in slide beamers), microarray production has changed remarkably. Bench-top instruments have been developed that enable the in situ parallel synthesis of many oligoprobe arrays, each with thousands of features. The basic aim of the present study was to use one of the first microarray instruments of its kind. The Geniom One (febit biomed GmbH, Heidelberg, Germany) platform was used to produce oligonucleotide arrays in the 3´ → 5´ and 5´ → 3´ directions. Reaction parameters were determined for diagnostic purposes for two different diagnostic assay formats: oligonucleotide hybridization and APEX. The main aim was to understand how the biochip microchannel, as the reaction vessel, influences the hybridization or APEX reaction parameters. Parameters affecting the success of the APEX reaction, such as hybridization temperature, PCR product concentration, incubation time, and signal intensity variability, were analyzed and optimized.

in situ sünteesitud oligonukleotiidide mikrokiibi disain, funktsionaliseerimine ja rakendamine

Oligonukleotiidide mikrokiibi tehnoloogia platvormi on senini käsitletud kui kiiret, odavat ja paindlikku genoomse variatsiooni analüüsi meetodit. Vastavalt sellele, millist biloogilist materjali kasutataskes mikrokiibile sidumiseks, nimetatakse neid spetsiifilisemalt näiteks DNA, oligonukleotiidide, raku, koe, valgu, antikeha, peptiidi jne. mikrokiipideks. Kuigi kommertsiaalselt kättesaadavatel tehnoloogiatel on ka rida eeliseid (ostad ja kasutad etteantud piirides), säilib endiselt vajadus kiirelt ja spetsiifiliselt koostada erinevaid uusi DNA analüüsi- ja diagnoosikiipe. Käesolevas doktoritöös on kasutatud mikrokiipide valmistamiseks oligonukleotiidide paralleelset sünteesi in situ tehnoloogiat firmas febit biomed GmBH poolt ehitatud integreeritud aparaadiga ”Geniom One” (febit biomed GmbH, Heidelberg, Saksamaa). Nii on võimalik sünteesida oligopraimereid mõlemas, nii 5´-3´kui ka 3´-5´ sünteesi suunas. Esimene on vajalik Arrayed Primer Extension ehk APEX reaktsiooni läbiviimiseks, ja teine esitatud sünteesi suund nukleiinhapete hübridisatsiooni puhul kasutatavates meetodites. una mikrokiibi analüüsi abil soovitakse üheaegselt detekteerida aina suuremat arvu variatsioone, siis suureneb ka sellel toimuva analüüsireaktsiooni kompleksus. Seega kujuneb ühe mikrkokiikiibi praimeritemaatriksi kavandamine multiparameetriliseks ülesandeks. Käesolevas doktoritöös on esitatud ka reaktsioonisüsteemi enda parameetrite nagu reaktsiooniruumi geomeetria ja analüüdi molekulide massiülekande efekti mõju analüüsireaktsiooni (hübridisatsiooni) toimumise efektiivsusele. Kaheosalise hübridisatsiooni teooria mudeli (TCM) alusel on võimalik demonstreerida, et tugevalt difusioonist mõjutatud analüüsitavate molekulide transport oligonukleotiidide praimeritele on sõltuv reaktsiooni lahuse kontsentratsioonist ja sellest johtuvalt lahuse viskoossusest, lisaks mängib olulist rolli ka mikrokiibi pinna omadus.