The role of endocytosis in the protein transduction by cell-penetrating peptides.

Abstract

The discovery of cell-penetrating peptides (CPPs) 20 years ago raised expectations to reach a new level of possibilities in the biological and therapeutic field. Because of the ability to translocate across the plasma membrane, a barrier that usually prevents the uptake of big hydrophilic molecules, CPPs were considered to become the vehicles that enable to reach intracellular targets. However, in spite of the impressive amount of knowledge about CPPs gathered by now both in vitro and in vivo systems, more questions are raised than answers found. The initial view on the translocation of CPPs directly through the plasma membrane has been substituted by the endosomal uptake, at least for big cargo molecules, although in several cellular systems the direct translocation of the peptides through the plasma membrane has been reported. This thesis focuses on elucidating the efficiency and mechanism of protein cellular delivery of six CPPs – transportan, TP10, Tat peptide (pTat), penetratin, pVEC and oligoarginine. By using fluorescence and electron microscopy, flow cytometry and spectrofluorimetry we found that the protein transport with transportans, pTat and penetratin is dependent on cellular energy and membranous cholesterol, and that it takes place via several endosomal pathways in parallel: clathrin- and caveolin-dependent endosomes and in macropinosomes, while no exploitation of flotillin-dependent pathway was detected. By observing the cellular fate of complexes-containing endosomal vesicles, we found that the majority of these endosomes are directed to degradative organelles in concentration-dependent manner while transportan is able to induce a fraction on non-acidic endosomes, which, based on the results from electron microscopy we propose to enable the escape of its contents. Osade peptiidide võime eukarüootsete rakkude plasmamembraani läbida avastati u 20 aastat tagasi. Sellest ajast on neid ühendeid, mida nüüd nimetatakse rakku sisenevateks peptiidideks (RSP), aktiivselt uuritud eelkõige just nende võime tõttu vahendada rakkudesse suuri hüdrofiilseid molekule. See omadus võimaldaks kasutada RSP-sid ravimite transpordil rakku. Vaatamata uuringutele puudub aga siiani ühene seisukoht RSP-de rakku sisenemise mehhanismide osas. Teada on vaid, et raku plasmamembraani läbimise viisi määramises on olulised peptiidi sekundaarstruktuur, laeng ja lastmolekuli suurus ning et sisenemine võib toimuda nii endosomaalsete vesiikulite kaudu kui ka liikumise teel otse läbi membraani ilma vesikulaarse kandjata. Käesolevas doktoritöös on analüüsitud kuue erineva rakku siseneva peptiidi – transportaani, TP10, penetratiini, Tat peptiidi, pVEC-i ja oligoarginiini – võimet transportida rakku valgu-molekule, rakendades analüüsivahenditena fluorestsents- ja elektronmikroskoopiat, läbivoolu-tsütomeetriat ja spektrofluoromeetriat. Esmalt on vaadeldud peptiidi ja valgu komplekside rakku liikumise efektiivsust ja seejärel analüüsitud selle valgutranspordi mehhanisme. Leidsime, et testitud RSPd toimetavad valku rakkudesse erineva efektiivsusega, rakuenergiast ja plasma-membraani kolesteroolist sõltuvalt ning kasutades selleks erinevaid endosomaalseid radu üheaegselt: detekteerisime peptiid-valk-komplekse nii makropinosoomides, kaveosoomides kui ka klatriin-sõltuvates endosoomides. Samas selgus, et protsessis ei osale endotsütoos flotilliiniga märkunud vesiikulite kaudu. Vaadeldes peptiidi ja valgu komplekse sisaldavate endosoomide rakusisest suunamist, selgus, et kui suurem osa komplekse liigub lagundatavatesse ja happelistesse rakuorganellidesse (nagu enamik ühendeid, mida rakk ei vaja), siis eeskätt transportaaniga valku rakku viies jääb osa komplekse vesiikulitesse, mille happesus eriti ei lange. See lubab oletada, et teatud tingimustel suudab transportaan endosoomi hapestumist takistada, mis ehk soodustab ka komplekside lekkimist endosoomist välja. Seda teooriat toetavad elektronmikrosoopia tulemused, mille kohaselt mõned transportaan-streptavidiini kompleksid olid nähtavad rakkude tsütosoolis väljaspool endosomaalseid vesiikuleid.