Molecular function of the first PHD finger domain of Autoimmune Regulator protein

Abstract

Negative selection of self-reactive T-cells in the thymus is the fundamental process that ensures proper central self-tolerance. The basis for negative selection is the presentation of self peptides to developing thymocytes which relies on the availability of different self proteins in the thymus. The AIRE protein has a unique role in this process as it promotes the expression of large number of tissue-specific antigens in medullary thymic epithelial cells thus making them available for presentation to thymocytes. In our studies, we focused on the molecular mechanisms of AIRE mediated promiscuous gene expression of tissue-specific genes. More specifically, we studied the function of the first PHD finger domain of AIRE since this domain was recently shown to interact with histone H3 N-terminal tails. We identified that similar to other proteins with PHD fingers, AIRE can directly interact with histone H3 through its first PHD zinc finger domain, and that several histone H3 N-terminal modifications interfere with this interaction. We also showed that AIRE can bind to mononucleosomes in vitro and that it selectively interacts with histones in vivo. Furthermore, using a model system, HEK293 cell-lines stably expressing AIRE, we showed that AIRE preferentially activates genes that are tissue-specific and characterized by low levels of initial expression. We also identified that AIRE regulated genes lack active chromatin marks H3K4me3 and AcH3 on their promoters. During the activation by AIRE, some of the target genes acquire histone H3 posttranslational modifications associated with transcription and RNA polymerase II, suggesting that AIRE mediated increase in mRNA levels is mediated, at least in part, at the transcriptional level. Finally, we confirmed our current model of AIRE function by showing that AIRE target genes have low levels of H3K4me3 on their promoters in vivo by studying histone posttranslational modifications in mouse thymus and peripheral tissues. In summary, our studies have led to the identification of novel molecular mechanism how AIRE can be recruited to certain regions in chromatin. This recruitment results in preferential activation of tissue-specific genes, which is needed for the establishment of proper central tolerance.

Üheks olulisemaks mehhanismiks immunoloogilise tolerantsi kujunemisel on T-rakkude negatiivne selektsioon tüümuses. Selles protsessis on oluline roll AIRE (Autoimmuunregulaator) valgul, mis vastutab suure hulga koespetsiifiliste geenide ekspressiooni eest tüümuses, mida on seejärel võimalik presenteerida arenevatele T-rakkudele. See omakorda tagab korrektse negatiivse selektsiooni. Käesolevas töös on uuritud, kuidas AIRE valk reguleerib koespetsiifiliste geenide ekspressiooni tüümuses, keskendudes AIRE valgu esimese PHD domeenile (PHD1) kuna hiljuti näidati, et antud domeenid teistes valkudes on võimelised seostuma histoon H3-ga. Oma töödes näitasime, AIRE valk on võimeline läbi oma PHD1 domeeni interakteeruma histoon H3-ga in vitro ja et erinevad N-terminaalsed posttranslatsioonilised modifikatsioonid nagu lüsiin 4 trimetüleerimine (H3K4me3) segavad seda seondumist. Lisaks näitasime, et AIRE valk on võimeline interakteeruma mononukleosoomidega ja selektiivselt histoonidega millel puudub H3K4me3 in vivo. Kasutades mudelsüsteemi, milles AIRE valku ekspresseeritakse püsivalt HEK293 rakkudes näitasime, et AIRE valk on võimeline HEK293 rakkudes aktiveerima suure hulga geenide ekspressiooni, millest paljud on koespetsiifilised ja algselt madala ekspressiooniga. Samuti näitasime, et AIRE märklaud geenide promootoritel puuduvad aktiivse kromatiini märgised. AIRE poolt vahendatud aktivatsiooni järgselt toimuvad mitmetel tema märklaudgeenidel muutused histoonide posttranslatsioonilistes modifikatsioonides ja RNA polümeraas II taseme tõus. See näitab, et AIRE vahendatud geeniekspressiooni aktivatsioon toimub, vähemalt osaliselt, transkriptsioonilisel tasemel. Histoonide posttranslatsiooniliste modifikatsioone uurimine in vivo hiire tüümuses ja perifeersetes kudedes kinnitas, et AIRE märklaudgeenide promootoritel tüümuses on madal H3K4me3 tase. Kokkuvõtteks võib öelda, et meie uurimistöö tulemused on viinud uue molekulaarse mehhanismi avastamiseni, kuidas läbi seondumise mittemodifitseeritud histoon H3 N-terminaalsete sabadega AIRE valk eelistatult interakteerub teatud kromatiini piirkondadega. Selle tagajärjel aktiveeruvad eelistatult koespetsiifilised geenid, mis omakorda on vajalik korrektse tsentraalne tolerantsi tekkimiseks.