From Barmah Forest virus to host RNA-derived PAMPs: divergent replicase functions and conserved innate immune activation by alphavirus replicases

Abstract

Alfaviirused on väikesed RNA genoomiga viirused, mis on levinud ülemaailmselt. Peamiselt levivad need sääskedega ning paljud alfaviirused põhjustavad inimestel haigusi. Nakkuse korral võib esineda kergemaid haigussümptomeid, aga alfaviirused võivad põhjustada ka rasket ja kroonilist artriiti või surmavat entsefaliiti. Ajalooliselt on ohtlikumaid alfaviiruseid peetud (lähis)troopiliste piirkondade mureks, kuid käesoleval sajandil on näiteks algselt Aafrikast pärit artriiti põhjustav chikungunya viirus kanda kinnitanud Aasias ja Ameerikas ning kohalikke nakkuspuhanguid on esinenud juba Euroopa lõunapoolsemates piirkondades. Ulatusliku leviku on taganud inimeste laialdane reisimine ja viiruse kandjateks sobivate sääskede esinemine uutes piirkondades. Kliimamuutuste tagajärjel eeldatakse selliste sääseliikide üha suuremat põhjapoolsemat levimist. Alfaviiruste põhjustatud haiguste leevendamiseks spetsiifilisi ravimeid saadaval pole, aga kaks alfaviiruste vastast vaktsiini on juba saadaval, mõlemad chikungunya viiruse vastu. Vaktsiine ühegi teise meditsiiniliselt olulise alfaviiruse vastu pole. Kliiniliselt oluline on ka Austraalias leviv Barmah Forest viirus (BFV), mis nakatunud inimestel põhjustab palavikku, peavalu, lihas- ja liigesvalusid ja ulatuslikku nahalöövet. Käesolevas töös lõime loodusliku BFV variandi genoomijärjestuse põhjal laboratoorse viirusklooni, et uurida lähemalt selle fülogeneetiliselt eristuva alfaviiruse molekulaarbioloogiat. Peamine fookus töös oli viiruse replikaasi, ehk viiruse RNA paljundamise eest vastutava masinavärgi uurimisel. Laboratoorse viiruse klooni kasutamisel tuvastasime funktsionaalse seose replikaasi valgu nsP2 ja ühe varasemalt käsitlemata nsP4 valgu piirkonna vahel. BFV-le unikaalselt omase leiuna täheldasime valgu nsP3 ümberpaiknemine rakutuuma. Viiruse genoomi muutmine võimaldas katseliselt kinnitada, et nsP3 paiknemine rakutuuma annab BFV-le selge kasvueelise, kuid pole viiruse elumuseks määrava olulisusega. Näitasime ka, et BFV replikaas on võimeline rakkudes aktiveerima kaasasündinud immuunvastust viiruslike RNA matriitside puudumisel. See on nähtus, kus alfaviiruse replikaas paljundab peremeesraku päritolu RNA-sid ja sünteesib RNA-d, mis on tuvastatavad raku ohuretseptorite poolt. Katsetest 11 erineva alfaviiruse replikaasiga järeldasime, et kõik replikaasid pole võrdselt võimekad selliseid RNA-sid tootma, kuid tõenäoliselt on tegu perekonnale universaalse omadusega. Täheldasime erinevusi ka sama viiruse erinevate looduslike variantide replikaaside vahel, mis võib osalt seletada erinevusi põhjustatavates sümptomites. Töö tulemused avardasid alusteadmisi nii alfaviiruste replikatsiooni mitmekesisusest kui ka ühistest omadustest interaktsioonil peremeesorganismiga, mida on oluline mõista spetsiifiliste ravimite ja vaktsiinide arendamisel. Alfaviiruste replikatsiooni masinavärki kasutatakse mõnedes kaasaegsetes vaktsiinides antigeeni tootmise tagamiseks ning asjaolu, et alfaviiruste replikaasid ärgitavad immuunvastust ka viiruslike matriitside puudumisel, võib olla oluline element selliste vaktsiinide väljatöötamisel ja tõhustamisel. Alphaviruses are a genus of mosquito-borne RNA viruses found worldwide, many of which are important human pathogens. Depending on the species, infection may cause symptoms ranging from mild febrile illness to severe, often chronic arthritis or fatal encephalitis. During this century, alphaviruses have expanded into new geographical regions, best exemplified by chikungunya virus, which has spread from its native Africa to Asia, the Americas, and warmer regions of Europe. Extensive global travel, suitable mosquito vectors, and favourable ecological conditions have enabled this expansion, while climate change is expected to further promote the northward spread of vector species. Although no specific antiviral drugs are available, two alphavirus vaccines, both against chikungunya virus, have recently been developed. However, vaccines against other alphaviruses of medical importance remain unavailable. One such virus is Barmah Forest virus (BFV), endemic primarily to Australia, which causes fever, muscle and joint pain, fatigue, headache, and prominent rash in humans. To investigate its molecular biology, this work established an infectious clone of a natural BFV isolate, providing a genetically defined system to study the molecular biology of this phylogenetically distinct alphavirus. Using this clone, we identified a functional link between the replicase protein nsP2 and a previously unexplored region of nsP4. For BFV, we also observed the rare nuclear localization of nsP3 during infection and established that nuclear presence of nsP3 is advantageous, but dispensable, for BFV replication. Furthermore, BFV replication machinery activated the innate immune response in the absence of viral RNA amplification, a phenomenon where alphavirus replicases use host RNA to generate immuno-stimulatory transcripts. This activity was also observed for 10 other alphavirus replicases, suggesting it is likely universal across the genus. Its potency varied between alphavirus replicases and, importantly, even between isolates of the same virus, indicating that it may contribute to differences in infection outcomes. Together, these findings highlight both the diversity of alphavirus replication strategies and common features of virus-host interactions, both important for developing virus-specific countermeasures. Moreover, innate immune activation by alphavirus replicases alone has implications for the development of modern vaccines that utilize the complete alphavirus replication machinery for antigen expression.