The horizontal gene pool for aromatics degradation: bacterial catabolic plasmids of the Baltic Sea aquatic system

Abstract

Läänemerd peetakse üheks kõige saastatumaks veekoguks maailmas. See on tiheda laevaliikluse ning mere valgalas toimuva intensiivse inimtegevuse tagajärg. Läänemere ökosüsteemi peamiseks ohuks (eutrofeerumise kõrval) on õli ja toornafta aktiivne transportimine ja hoiustamine ning kasutamine antud regioonis. Reostuse korral veekeskkonda sattuvad aromaatsed ühendid (benseen, naftaleen, tolueen jne) on Läänemere tundlikku ökosüsteemi ohustavad toksilised saasteained. Bioremediatsiooni ehk reoainete kõrvaldamist mikroobide abil peetakse efektiivseks ja paljulubavaks tehnoloogiaks reostusega võitlemisel, sest bakterid on kohastunud aromaatsete ühendite lagundamiseks ning nad omavad selleks erinevaid katabolismiradu. Nende katabolismiradade ensüüme kodeerivad geenid võivad paikneda nii kromosoomis kui ka väljaspool kromosoomi, DNA molekulides, mida nimetatakse plasmiidideks. Plasmiidid soodustavad kataboolsete geenide horisontaalset ülekannet ühest bakterirakust teise (rakkudevahelise kontakti moodustamisel) ning sellega kaasnevat biodegradatiivsete omaduste levimist bakterikoosluses. Vaatamata sellele, et kataboolsete plasmiidide oluline roll bioremediatsioonil on kinnitust leidnud ning Läänemere mikroobide liigiline koosseis on juba aastaid olnud teadlastele meelepärane uurimisteema, on Läänemere plasmiidne kooslus praktiliselt tundmatu ning jäänud uurijate tähelepanuta. Antud töö keskendub Läänemerest isoleeritud bakteritüvede kataboolsetele plasmiididele, täpsemalt nende plasmiidide tuvastamisele, taksonoomiale ning geneetilise struktuuri ja koostise määramisele. Uurimistöö tulemusena leiti, et plasmiide sisaldavatel bakteritel on suur osakaal Läänemere kultiveeritavate mikroobide seas, kuna ligi kolmandik isoleeritud bakteritüvedest sisaldas ühte või mitut plasmiidi. Samuti leiti, et nendele plasmiididele on omane ainulaadne geenide kogum. Kuuekümne ühest (61) plasmiide kandvast Läänemere isolaadist kümnel (10) detekteeriti plasmiid, mis kuulub tuntud kataboolsete plasmiidide perekonda IncP-9. Antud plasmiidide rühma esindajaid leiti ka kõikidest Läänemere veeproovidest kultiveerimisest sõltumatu metoodika abil, mis põhineb eraldatud mikroobikoosluse DNA analüüsil. IncP-9 plasmiidid tuvastati ka Läänemere valgalas, põlevkivi kaevandamise ja põlevkivil baseeruva tööstusepoolt saastatud jõe ja mulla proovidest. Nii laborikatsetes kui ka otse looduskeskkonnas detekteeriti nende plasmiidide horisontaalne ülekanne bakterite vahel, mille tagajärjel omandasid mikroobid võime ladundada aromaatseid saasteühendeid ning läbi selle kohastuda ning jääda ellu toksilises keskkonnas. Antud uurimistöös näidati, et IncP-9 plasmiidide rühma võib käsitleda kui kataboolsete geenide kandjaid ja levitajaid looduses ning kaasata neid eduka bioremediatsiooni tehnoloogia arendamisel. Peale IncP-9 plasmiidide rühma keskenduti senitundmatut tüüpi kataboolsete geenide kandjate iseloomustamisele, kuna enamus Läänemerest isoleeritud bakterite plasmiididest ei kuulunud tuntud plasmiidide rühmadesse, mida tavaliselt seostatakse aromaatsete ühendite lagundamisega, näidates Läänemere plasmiidide ainulaadset kooslust. Bakteritüvest Pseudomonas migulae D2RT isoleeritud tolueeni lagundamiseks vajalikke geene kandva plasmiidi pD2RT põhjalik analüüs osutas selle plasmiidi lähedasele sugulusele taimepatogeenides esinevate virulentsuse eest vastutavate plasmiididega, mis võimaldab iseloomustada plasmiide kui universaalseid, erinevaid funktsioone kodeerivate geenide kandjaid ja levitajaid looduses. Käesolev uurimistöö annab väärtuslikku informatsiooni kataboolsete omadustega bakteritüvedest, kes isoleeriti eesmärgiga kasutada neid efektiivse bioremediatsiooni tehnoloogia arendamisel.

The Baltic Sea is considered one of the most polluted reservoirs in the world, which is a result of accelerated shipping traffic and intensive human activity in its catchment area. Oil and oil spills, along with eutrophication, constitute the main threats to the Baltic Sea ecosystem because of the large amount of oil used, transported and stored in the region. In case of oil pollution, toxic aromatic compounds like benzene, toluene and naphthalene get into the water thereby endangering the vulnerable ecosystem of the Baltic Sea. Bioremediation, removal of contaminants by using microorganisms, is thought to be an effective and promising technology to cope with the problem of environmental pollution. Bacteria have adapted to degradation of aromatic compounds through evolvement of different catabolic (degradative) pathways. Genes encoding the enzymes that form these catabolic pathways are located either on the chromosome or on separate DNA molecules termed plasmids within the bacterial cell. Plasmids contribute to horizontal transfer of catabolic genes from one bacterial cell to the other through establishment of physical contact between two bacterial cells, which facilitates the spread of degradative capabilities within a bacterial community. Despite the assured importance of catabolic plasmids for bioremediation, and years of research on the bacterial community structure of the Baltic Sea, the study of the Baltic Sea plasmid community has so far been neglected. The present work was dedicated to investigation of catabolic plasmids that reside in cultivable bacteria of the Baltic Sea and in its catchment area. Particularly, the work was focused on identification and taxonomy of plasmids, characterization of their architecture and genetic content. Ten (10) out of sixty one (61) plasmid-bearing bacterial strains isolated from Baltic Sea water were found to carry plasmids belonging to the famous IncP-9 family of catabolic plasmids. Plasmids of this group have also been detected in all Baltic Sea water samples using a cultivation-independent approach that is based on DNA analysis of the total bacterial community. In addition, IncP-9 plasmids were isolated from the Baltic Sea catchment area, from polluted soil and river water samples taken near the oil shale mining and processing industry in Estonia. During separate laboratory experiments and in conjunction with the case study under natural conditions in the environment, the horizontal transfer of these plasmids has been detected. As a result, the recipient strains gained the ability to degrade aromatic compounds and adapted to toxic environmental conditions. The IncP-9 plasmid family can be considered as an important plasmid group for keeping and dissemination of catabolic genes in nature. The present work brings this plasmid group forward as proper candidates for development of bioremediation technologies. Besides the IncP-9 plasmid family the work concerns new types of catabolic plasmids. Most of the plasmids highlighted in this study, did not fall within well-known plasmid families, which are usually associated with bacterial degradative capabilities, referring to the unique genetic composition of the Baltic Sea catabolic plasmids. Analysis of the plasmid pD2RT, a new type of catabolic plasmid that enables the host bacterial strain Pseudomonas migulae D2RT to degrade toluene, revealed its close relatedness to the plasmids of plant pathogenic bacteria. Thus, plasmids could be considered as universal carriers and propagators of a variety of genes in nature that may encode distinct functions. The present research provides valuable information on the degradative bacterial strains isolated in order to use them in the development of effective bioremediation technologies for the Baltic Sea and its surrounding area.