Ribosome assembly factors in Escherichia coli

Abstract

Ribosome assembly factors in Escherichia coli

Ribosome assembly is a highly complex and coordinated process during which many ribosomal and extra-ribosomal factors participate in it. Bacterial 70S ribosome consists of a large (50S) and small (30S) subunit, both of which contain ribosomal RNA (rRNA) and ribosomal proteins. Ribosome assembly starts shortly after the transcription initiation of ribosomal RNA and consists of rRNA and r-protein processing, modification and folding together with the final association of ribosomal components into functional ribosomes. Under normal conditions, ribosome assembly is finished within minutes after the start of rRNA transcription whereas in vitro reconstitution from purified ribosomal components requires numerous long incubations and heating steps. In a way, this suggests that other (extra-ribosomal) factors are required for the efficiency of the ribosome assembly process. Extra-ribosomal factors include proteins with many different activities, for example RNA and protein modification enzymes, RNA helicases, ribosome-dependent GTPases, heat-shock proteins and RNA chaperones. In this study the roles of pseudouridine synthase RluD and RNA helicase DeaD in the ribosome assembly process were characterized. The absence of both RluD and DeaD caused defects in ribosome assembly, characterized by the accumulation of abnormal ribosomal particles. The 40S particles from DeaD-deficient cells were catalytically inactive but capable of final maturation to functional ribosomes, albeit at slower rate than in wild-type cells. It was also determined that pseudouridine synthase RluD acts in the late step of ribosome large subunit assembly and is highly specific to pseudouridines at positions 1911 and 1917 in Escherichia coli 23S rRNA. Finally a highly conserved SPOUT-family methyltransferase RlmH (previously YbeA) present in all kingdoms of life (Bacteria, Archaea, Eukaryota) and responsible for the methylation of pseudouridine at position 1915 in Escherichia coli 23S rRNA was identified.

Ribosoomide kokkupakkimise faktorid soolekepikeses Escherichia coli

Ribosoomide süntees ja kokkupakkimine on äärmiselt keeruline tegevus, kus osaleb mitmeid ribosomaalseid ja mitte-ribosomaalseid faktoreid. Bakteriaalne 70S ribosoom koosneb kahest alamühikust – suurest (50S) ja väiksest (30S) alamühikust, mis omakorda koosnevad ribosomaalsest RNA-st (rRNA) ning ribosomaalsetest valkudest (r-valkude). Ribosoomide kokkupakkimine algab samaaegselt rRNA transkriptsiooniga ning sisaldab endas nii rRNA kui ka r-valkude protsessimist, modifitseerimist ning ruumilist voltumist; samuti nende komponentide omavahelist assotsieerumist funktsionaalseteks ribosomaalseteks alamühikuteks. Normaalsetes tingimustes toimub ribosoomide kokkupakkimine mõne minuti jooksul, samas kui in vitro tingimustes nõuab see mitmeid pikki inkubatsioone ja tempearatuurimuutusi. Ribosoomide kokkupakkimises osalevate mitte-ribosomaalsete faktorite hulka kuuluvad näiteks RNA modifikatsiooniensüümid, RNA helikaasid, kuumaehmatusvastuse valgud (heat-shock proteins), ribosoom-sõltuvad GTPaasid ning RNA abipakkijad (RNA chaperones). Käesolevas töös iseloomustati pseudouridiini süntaasi RluD ja RNA helikaasi DeaD osalust ribosoomide kokkupakkimisel. Nende valkude puudumine tekitas ribosoomide kokkupakkimises olulisi häireid, mis tipnesid ebanormaalsete ribosomaalsete partiklite kuhjumisega. RNA helikaasi DeaD-defektses tüves kuhjunud 40S partiklid olid katalüütiliselt inaktiivsed, kuid samas võimelised in vivo tingimustes küpsema funktsionaalseteks ribosoomideks, seda küll oluliselt aeglasemalt kui metsik-tüüpi rakkudes. Ühtlasi ilmnes, et pseudouridiini süntaas RluD osaleb ribosoomide kokkupakkimise viimases etapis ning on ülimalt spetsiifiline Escherichia coli 23S rRNA positsioonides 1911 ja 1917 asuvate pseudouridiinide suhtes. Viimasena tuvastati kõigis kolmes loomariigis (bakterid, ürgid ning päristuumsed) esindatud ning kõrgelt konserveerunud SPOUT-perekonna metüültransferaas RlmH (YbeA), mis katalüüsib Escherichia coli 23S rRNA positsioonis 1915 asuva pseudouridiini metüleerimist.