Role of alphavirus replicase in viral RNA synthesis, virus-induced cytotoxicity and recognition of viral infections in host cells

Abstract

Alfaviirused on positiivse polaarsusega RNA genoomsed viirused. Alfaviiruste levik selgroogsete peremeeste vahel toimub enamasti lülijalgsete vektorite vahendusel. Alfaviiruste perekonda kuulub ka suure meditsiinilise tähtsusega Chikungunya viirus (CHIKV). CHIKV infektsiooni iseloomustab kõrge palavik, lööve ja lihasevalu, eriti iseloomulik on aga liigesevalu, mis võib muutuda krooniliseks ning kesta kuid või isegi aastaid. Praeguseks hetkeks puudub selle viiruse vastane vaktsiin või spetsiifiline ravim, võimalik on leevendada vaid sümptomeid. Kliima muutused ja ülemaailmne reisimine on võimaldanud CHIKV-l levida ka piirkondadesse, kus teda varem ei ole olnud. Näiteks jõudis CHIKV 2013. aasta lõpus Ameerikasse, kus tema levik on võtnud epideemia mõõtmed. Seetõttu on CHIKV uurimine intensiivistunud, kuid siiski on tema kohta käivad teadmised lünklikud ja ebapiisavad. Selleks, et välja töötada CHIKV vastaseid vaktsiine või ravimeid tuleb esmalt põhjalikult uurida tema molekulaarbioloogiat ja, mis veelgi olulisem, mõista kuidas CHIKV ja tema peremees teineteist vastastikku mõjutavad. Paraku on tegemist ohtliku patogeeniga, mille töötamine on raskendatud kõrgest bioohutuse tasemest tulenevate tingimuste tõttu. Seetõttu on CHIKV uuringuteks eriti vajalikud ohutud ja samas ka efektiivsed tööriistad. Seega antud uurimustöö eesmärgiks saigi selliste tööriistade väljatöötamine, mis hõlbustaksid CHIKV uurimist. Esmalt konstrueerisime mittetsütotoksilised CHIKV replikonid, mis võimaldavad neid sisaldavate rakkude järjepidevat paljunemist. Töö käigus loodi püsiliinid ja tehti kindlaks erinevad mutatsioonide kombinatsioonid nsP2 valgus, mis vähendasid CHIKV replikoni tsütotoksilisust. Iseloomustati ka mutatsioonid nsP1 ja nsP3 valkudes, mis võimaldasid mittetsütotoksilise CHIKV replikoni püsimist inimese rakkudes. Läbiviidud analüüsid näitasid, et mutatsioonid nsP2 valgus mõjutavad selle ensümaatilisi aktiivsuseid ning vähenenud tsütotoksilisusega fenotüübid erinevad molekularsete mehhanismide poolest. Lisaks leiti, et sellised stabiilsed ja markervalke tootvad rakuliinid kujutavad endast efektiivseid ja ohutuid tööriistu, mis võimaldavad CHIKV vastaste inhibiitorite otsimist ja nende toime analüüsimist. Teiseks töötasime välja uudse CHIKV põhise trans-replikaasi süsteemi, kus replikaasi valkude tootmine ja nende poolt läbiviidav RNA paljundamine on teiseteisest lahutatud. Näitasime, et selline süsteem võimaldab uurida erinevate mutatsioonide või mittestruktuursetele valkudele lisatud tagide otseseid efekte replikaasi võimele läbi viia RNA sünteesi. Võrrelduna infektsioonilise viirusega omab CHIKV trans-replikaas sellistes analüüsides selgeid eeliseid, sest viiruse kontekstis põhjustavad paljud mutatsioonid geneetilist ebastabiilsust. Lisaks leidsime, et konstueeritud trans-replikaasi süsteem võimaldab väga edukalt uurida viiruse ja peremeesraku vahelisi interaktsioone. SFV trans-replikaasi kasutades avastasime alfaviiruste replikaasi uue funktsiooni – võime kasutada rakulisi RNAsid sünteesimaks kaasasündinud immuunvastust aktiveerivaid kaheahelalisi RNA molekule. Samas aga selgus huvitav tõsiasi, et CHIKV replikaas ei ole võimeline meie poolt kirjeldatud viisil immuunsüsteemi aktiveerima. Seega leidsime, et kahe väga sarnase alfaviiruse äratundmine peremeesraku poolt toimub väga erineval moel. Käesoleva uurimustöö käigus on loodud rida unikaalseid ja efektiivseid CHIKV molekulaarbioloogia uurimise tööriistu. Nende kasutamine on võimaldanud paremini mõista nii CHIKV molekulaarbioloogiat kui ka alfaviirus - peremees vahelisi interaktsioone.Alphaviruses are a group of globally distributed mosquito-borne RNA viruses. This group includes several important human pathogens, such as the re-emerging Chikungunya virus (CHIKV). Recent outbreaks of CHIKV infection are responsible for millions of cases of acute illness and frequent long-term complications. There is no specific antiviral treatment or licensed vaccine available for the clinical management of CHIKV infection. One of the obstacles in the identification of new therapeutic agents and strategies against CHIKV has been the highly biohazardous nature of this virus, the study of which requires special biosafety conditions, as well as the lack of suitable technical tools for CHIKV research. Thus, the development of an efficient and verified set of tools represents an important asset for such studies. The aim of the current thesis was to develop and apply novel tools to study the molecular biology of CHIKV and different aspects of its interactions with hosts. First, we developed CHIKV replicons capable of persistent replication in vertebrate cell lines. This was achieved by the selection, identification and analysis of different mutations located in the nsP2 protein of CHIKV. The noncytotoxic phenotype of CHIKV replicons, resulting from these mutations, represents a consequence of functional defects caused by these mutations. Furthermore, we found that the different combinations of mutations that caused a noncytotoxic phenotype most likely acted through different molecular mechanisms. In addition, the cell lines harboring our noncytotoxic replicons, which also contained sequences encoding marker proteins, possessed good stability and represent safe and useful models for the screening of compounds with antiviral activity. Second, we constructed a novel CHIKV-based trans-replication system in which the production of viral replicase proteins and replicase-mediated RNA replication/transcription processes are uncoupled from each other. We demonstrated that this system represents an excellent tool for analysis of the effects caused by different mutations or tags introduced into replicase proteins. The unique properties of the trans-replicase we developed make it especially useful for studies of mutations that cause instability in the context of replicating RNA genomes. Third, we found that the trans-replicase system we developed is a good tool for studies of virus-host interactions. The combined use of SFV and CHIKV trans-replicases, their mutant variants and the corresponding viruses revealed important differences in how these viruses are recognized by host cells. Taken together, the studies published in this thesis allowed better understanding of virus replication and provided novel insights into the interactions that exist between alphaviruses and innate immune response pathways.