Study of the Papillomavirus Genome Replication and Segregation

Abstract

Papilloomiviirused on ümbriseta ja kaheahelalise DNA genoomiga viirused, mis on rangelt liigispetsiifilised. Siiski on inimest võimelised nakatama enam kui sada erinevat HPV tüüpi. Kõige levinumateks kasvajaid tekitavateks viirusteks on HPV16 ja HPV18, millede nakkuse vältimiseks on arendatud ka vaktsiinid. HPV vastane vaktsineerimine vähendab haigestumise tõenäosust vähemalt 70%, kuid täielikku kaitset see paraku pakkuda ei suuda. Lisaks on olemasolevad vaktsiinid mõeldud ainult haiguste ennetamiseks ja on kasutud viirusega juba nakatunud inimestele. Paraku ei ole veel välja töötatud ravimeid, mis oleksid võimelised papilloomiviiruse infektsiooni inimese organismist kõrvaldama. HPV on kõrge koespetsiifilisusega viirus ja nakatab epiteeli peamist rakutüüpi – keratinotsüüte. Nakatamiseks peab viirus sisenema naha epiteeli basaalkihi rakkudesse või genitaalide ja teiste organite limaskestade vastavatesse rakkudesse. Kuna HPV elustükkel sõltub täielikult keratinotsüütide diferentseerumisest, siis selle viiruse uurimist raskendab asjaolu, et uurimistöös kasutatavates rakulistes mudelsüsteemides on keratinotsüütide diferentseerumise käivitamine väga keerukas. Antud uurimistöös kirjeldatakse inimese sääreluu kasvajast algatatud U2OS rakuliinil põhinevat rakulist mudelsüsteemi, mida saab kasutada HPV genoomide replikatsiooni uurimiseks. Loodud mudelsüsteem on võimeline toetama erinevat tüüpi HPVde DNA replikatsiooni nii nagu see toimub viiruse loomuliku elutsükli eri etappidel. Samuti võimaldab mudelsüsteem võrdlevalt uurida nii limaskesta spetesiifilisi kõrgeriski (HPV16, HPV18), kui ka madalariski (HPV6b, HPV11) ning nahka nakatavaid (HPV5, HPV8) papilloomiviirusi, mille uurimine teistes rakulistes mudelsüsteemides on seni olnud üsna keerukas. Samuti näitame, et HPV DNA replikatsiooni on kaasatud vähemalt kaks erinevat mehhanismi. Ühte neist on varasemalt juba kirjeldatud kui võimalikku papilloomiviiruste päriliku materjali paljundamise meetodit – selleks on kahesuunaline theta-tüüpi replikatsioon. U2OS rakuliinil põhineva mudelsüsteemi abil tuvastasime aga veel teise, ühesuunalise replikatsioonimehhanismi, mis oletatavalt põhineb molekulidevahelisel homoloogsel rekombinatsioonil ja mille roll HPV elutsüklis on veel ebaselge. Lisaks ülaltoodule on käesolevas töös näidatud, et kõikide vajalike viiruseliste trans-faktorite juuresolekul on heteroloogsed originid, mis sisaldavad veise papilloomiviirusest (BPV1) või ka Epstein-Barr viirusest (EBV) pärinevaid segregatsioonielemente, võimelised tagama neid elemente sisaldavate originiplasmiidide stabiilse säilumise.

Papillomavirus infections are common in both people and animals. Generally, these viruses may result in asymptomatic infections and can cause benign tumors as condylomas and papillomas in mucous membranes or warts and skin papillomas. However, in the case of persistent infections, these viruses may induce malignant tumors at various body sites. Currently, there are two commonly used HPV vaccines on the market. The Gardasil (against HPV6/ HPV11/ HPV16/ HPV18) and Cervarix (HPV16 / HPV18) vaccines are preventive, they do not eliminate existing infection and have no therapeutic effect in diseases caused by HPV. A multivalent HPV therapeutic vaccine candidate against six HPVs was reported; however, this vaccine is only in preclinical studies, so there is an urgent medical need for drugs that suppress HPV DNA replication. HPV DNA replicates in the epithelial tissue, which is mostly composed of differentiating keratinocytes. HPV genomic DNA replication occurs in three clearly distinguishable phases, making the study and control of the virus complicated, because it is difficult to mimic all three stages of the virus infection cycle in the regular tissue culture cells under laboratory conditions. We demonstrate that HPV genomes replicate efficiently in the human osteosarcoma cell line U2OS, which is capable of supporting the genome replication of many different subtypes (α-HPVs of high-risk HPV18 and HPV16; low-risk HPV6b and HPV11 and β-HPVs of HPV5 and HPV8). U2OS cells capable of supporting the maintenance of the HPV genomes provide a useful model system to study the mechanisms and regulation of viral DNA replication during various phases of the viral life cycle, including initial amplification, stable maintenance and late amplification. We have demonstrated that two different mechanisms are involved in the HPV genome replication, shedding new light on the events that occur during the different phases of papillomavirus DNA replication. Finally, an analysis of the papillomavirus and the Epstein-Barr virus genomes segregation functions are included. Our data demonstrated that BPV1 E2 protein and minichromosome maintenance element (MME), or EBNA1 and FR-element dependent stable maintenance functions are necessary for the stable episomal multicopy nuclear replication of the plasmids with hybrid replication origin in different types of dividing cells.