The role of specialized DNA polymerases in mutagenesis in Pseudomonas putida

Abstract

Bacteria possess an amazing ability to adapt extremely diverse environments. Generation of mutations is an important source of biological diversity and evolution therefore contributing to adaptibility. Several lines of evidence indicate that there is positive correlation between stressful growth-restrictive environmental conditions and genetic variability within bacterial populations. Among different processes, error-prone DNA synthesis by specialized DNA polymerases has been shown to contribute to stress-induced mutagenesis in stationary-phase bacteria. Literature review of this thesis is focused on characterization of specialized DNA polymerases, their biological functions and involvement in stress-induced mutagenesis. In experimental part of my thesis I describe the involvement of specialized DNA polymerases in mutagenic processes in Pseudomonas putida stationary-phase population. P. putida is a soil bacterium colonizing very diverse habitats, being therefore continuously exposed to various environmental stresses including nutrient limitation. In order to investigate mutational processes in P. putida we constructed a set of novel test systems that allowing monitoring of 1-bp deletions and different base substitution mutations in separately throughout long-term period (at least 2 weeks) of carbon source starvation. The mutagenesis experiments with P. putida strains deficient for different specialized DNA polymerases revealed following: 1.Generation 1-bp frameshift mutations is significantly elevated as carbon source limitation proceeds more than one week. The occurrence of 1-bp deletions in late stationary-phase cells of P. putida depends on the presence of a Y-family DNA polymerase IV. 2.The DNA polymerase DnaE2, a homologue of -subunit of replicative DNA polymerase III and an Y-family DNA polymerase ImuB of P. putida that is encoded by DNA damage-inducible multiple gene cassette, have opposite effects on mutagenesis. ImuB contributes to the generation of both base substitution mutations and 1-bp deletions in P. putida stationary phase population whereas P. putida DnaE2 has a reducing effect on the occurrence of base substitutions which is in strict contrast with previously studied DnaE2 homologues of other organisms. 3.A DNA polymerase V homologue encoded by the rulAB genes of the toluene degradation plasmid pWW0 increases the probability of P. putida cells to accumulate beneficial mutations permitting to gain the growth advantage in stationary phase population. Bakteritele on üldiselt iseloomulik võime nii füsioloogiliselt kui ka geneetiliselt kiiresti muutunud keskkonnatingimustega kohaneda. Geneetilise adapteerumise ja evolutsioneerumise aluseks on erinevad mutatsiooniprotsessid. Ebasobivad, bakterite kasvu pärssivad keskkonnatingimused soodustavad mutatsioonide tekkimist. Mutatsioonide tekkes on oluline roll spetsialiseerunud DNA polümeraaside poolt läbiviidaval vigaderohkel DNA sünteesil. Käesoleva töö kirjanduse ülevaates kirjeldan erinevaid bakteriaalseid spetsialiseerunud DNA polümeraase ja nende funktsioone mutatsiooniprotsessides, sealhulgas ka stressi poolt indutseeritud mutageneesis. Doktoritöös esitatud tulemused käsitlevad erinevate spetsialiseerunud DNA polümeraaside osalust Pseudomonas putida nälgivates rakkudes toimuvates mutatsiooni protsessides. P. putida on mullabakter, mis asustab erinevaid vee ja pinnase keskkondi. Mullabakterite looduslikus elukeskkonnas on pikki perioode kestev toiteainete puudus tavaline. Pikaajalise süsinikunälja tingimustes viibivas bakteripopulatsioonis toimuvate mutatsiooniprotsesside uurimiseks konstrueerisime komplekti uusi, fenooli süsinikuallikana kasutuselevõtul põhinevaid testsüsteeme, mis võimaldavad jälgida eraldi nii asendusmutatsioonide kui ka ühenukleotiidsete deletsioonide teket pseudomonaadide populatsioonis pikaajalise süsinikunälja tingimustes. Erinevate spetsialiseerunud DNA polümeraaside suhtes defektsete P. putida tüvedega läbiviidud mutageneesi katsed näitasid järgnevat: 1.Alates teisest nädalast süsinikunälja tingimustes suureneb ühenukleotiidsete deletsioonide tekkesagedus olulisel määral. Ühenukleotiidsete deletsioonide teke P. putida rakkudes sõltub DNA polümeraas IV olemasolust. 2.P. putida rakkudes omavad aktinobakteritest pärineva geenikasseti poolt kodeeritud DNA polümeraasid DnaE2 ja ImuB mutageneesile vastupidist efekti. ImuB soodustab statsionaarse faasi populatsioonis nii asendusmutatsioonide kui ka ühenukleotiidsete deletsioonide teket samas kui DnaE2 olemasolu vastupidiselt kõigile senikirjeldatud DnaE2 homoloogidele, vähendab P. putida rakkudes asendusmutatsioonide tekkesagedust. 3.Tolueeni degradatsiooni võimaldava plasmiidi pWW0 poolt kodeeritud DNA polümeraas V homoloog suurendab statsionaarse faasi populatsioonis geneetiliselt enam kohastunud mutantide tekkesagedust.