Kullerpeptiidi retseptori identifitseerimine lähiligeerimise meetodil

Abstract

Vaskulaarsed endoteelirakud avaldavad erinevaid omadusi sõltuvalt koe füsioloogilisest seisundist. Nende rakkude pinnaretseptorite sihtmärgistamiseks on välja töötatud vaskulaarsed kullerpeptiidid (ingl. vascular homing peptides, VHP), mida avastatakse in vivo faagidisplei abil. Kuna faagidisplei ei võimalda retseptorite kohest tuvastamist, kasutatakse nende leidmiseks sageli afiinsuskromatograafiat. Selle protsessi oluline etapp on rakkude lüüs, mille käigus vabanevad rakusisesed valgud, mis võivad häirida VHP-de seondumist sihtvalkudega, vähendades märgistamise spetsiifilisust. Selle piirangu ületamiseks töötati käesolevas töös välja mädarõika peroksüdaasist (HRP) sõltuv, VHP-ga suunatud lähiligeerimise meetod, mis võimaldab märgistada peptiidi läheduses paiknevaid valke elusrakkudes. Mudelsüsteemina kasutati kullerpeptiidi järjestusega RPARPAR (RPAR) ja selle retseptorit neuropiliin-1 (NRP-1). RPAR-HRP konjugaat võimaldas NRP-1 positiivsete rakkude selektiivset märgistamist AlexaFluor 647-türamiidi ja biotiin-türamiidiga. Märgistatud rakupinnavalgud isoleeriti afiinsuskromatograafia abil ning NRP-1 tuvastati Western blot’i ja massispektromeetrilise analüüsi kaudu. Antud töö tulemused näitavad, et VHP-ga juhitud lähiligeerimine on toimiv strateegia kullerpeptiidide sihtretseptorite tuvastamiseks terviklikel elusrakkudel.