Meetodite võrdlus gRNA efektiivsuse hindamiseks genoomi muundamisel CRISPR/Cas9 tehnoloogiat kasutades

Abstract

CRISPR/Cas9 eksperimendi efektiivsust mõjutab gRNA efektiivsus, mis juhib Cas9 valgu sihtmärkjärjestuseni, ning seetõttu on oluline hinnata disainitud gRNA-de efektiivsust genoomi muundamisel. Kirjanduse põhjal populaarseima meetodi T7 endonukleaas I tulemuste põhjal on raske hinnata gRNA tegelikku efektiivsust rakupopulatsioonis. Töös testitud kolm PCR-põhist meetodit: ACT-PCR, Bindel-PCR ja ORNi PCR ei andnud samuti rahuldavaid tulemusi. Nende meetodite puhul alahinnatakse populatsioonis olevate indelite osakaalu, sest rakupopulatsioonid sisaldavad ka muundamata järjestusi. Kuigi Sanger sekveneerimisel põhinevate meetoditega saab üldiselt edukalt hinnata indelite osakaalu ja gRNA efektiivsust, sõltuvad tulemused konkreetsest katsest. Kõige täpsema ja ülevaatlikuma pildi gRNA-de efektiivsusest ja tekkinud indelite sagedusest rakupopulatsioonis annab järgmise põlvkonna sekveneerimine