Structure and dynamics of photoactive proteins studied by (in situ-) neutron scattering methods

Abstract

Käesolevas doktoritöös uuritakse valgusaktiveeritavate valkude struktuuri ja dünaamikat, kasutades kaasaegseid neutron- ja röntgenhajumise meetodeid. Töö keskmes on Orange Carotenoid Protein (OCP), mis on tsüanobakterites oluline fotokaitsevahend, ning Water-Soluble Chlorophyll Protein (WSCP), mis toimib lihtsustatud mudelina pigment–valgu interaktsioonide uurimiseks. Nende valkude kaudu käsitletakse, kuidas valguse poolt esilekutsutud struktuurimuutused ja valgu paindlikkus määravad nende bioloogilise funktsiooni, eriti valguse kogumise ja energia hajutamise mehhanismide kaudu. Töö tugineb mitmete täiendavate eksperimentaalsete tehnikate integreerimisele, sealhulgas Small-Angle Neutron Scattering (SANS), Quasielastic ja Inelastic Neutron Scattering (QENS ja INS) ning Time-Resolved Small-Angle X-ray Scattering (TR-SAXS), et iseloomustada valgusaktiveeritavate valkude staatilisi struktuure ja dünaamilisi muutusi füsioloogilistele tingimustele sarnastes keskkondades. SANS-analüüs koos Size-Exclusion Chromatography (SEC) meetodiga võimaldab määrata OCP–FRP komplekside lahusstruktuurid ja oligomeersed olekud, heites valgust nende rollile OCP valgusaktiveerimise ja taastumisprotsessides. QENS-mõõtmised toovad esile erinevate OCP variantide ja WSCP sisemise liikumise ning selle, kuidas pigmentide sisaldus, lahusti viskoossus ja temperatuur mõjutavad valgu paindlikkust ja funktsiooni. TR-SAXS võimaldab reaalajas jälgida valguse poolt aktiveeritud OCPᴿ olekust taastumist tagasi algsesse OCPᴼ olekusse. Töö tulemused annavad tervikliku ülevaate sellest, kuidas valgusindutseeritud valkude struktuurne paindlikkus ja dünaamiline käitumine toetavad nende funktsionaalset ümberlülitust. Lisaks fotoprotektsiooni mehhanismide paremale mõistmisele tsüanobakterites annavad saadud teadmised olulise panuse bioinspireeritud valguskogumissüsteemide, sünteetiliste fotokaitsematerjalide ja optogeneetiliste rakenduste arendamiseks. Uurides nii keerukaid looduslikke süsteeme kui ka lihtsustatud mudeleid, aitab see doktoritöö paremini mõista struktuuri ja dünaamika seoseid valkude funktsiooni määramisel.This doctoral thesis investigates the structure and dynamics of photoactive proteins using state-of-the-art neutron and X-ray scattering techniques. The primary focus is on the Orange Carotenoid Protein (OCP), a key photoprotective component in cyanobacteria, and the Water-Soluble Chlorophyll-binding Protein (WSCP), a simplified model for studying pigment–protein interactions. These systems serve as models for understanding how light-induced conformational changes and protein flexibility regulate biological function, particularly in light-harvesting and energy dissipation processes. A combination of complementary experimental methods, including Small-Angle Neutron Scattering (SANS), Quasielastic and Inelastic Neutron Scattering (QENS and INS), and Time-Resolved Small-Angle X-ray Scattering (TR-SAXS), is used to characterize both static structures and dynamic transitions in protein systems under near-physiological conditions. In paper I, SEC-SANS is employed to resolve the solution structures and oligomeric states of OCP–FRP complexes, providing insights into their role in the photoactivation and thermal relaxation cycles of OCP. In paper II, QENS is used to assess the internal mobility of various OCP variants and in Paper III INS with QENS has been used to study WSCP systems, revealing how pigment content, solvent environment, and temperature influence protein flexibility and function. TR-SAXS captures the real-time conformational dynamics of the OCP during deactivation from its light-activated red form (OCPR) back to its resting orange form (OCPᴼ). The findings of this work offer a comprehensive picture of how protein structural plasticity and dynamic behavior underlie the functional switching mechanisms in photoactive proteins. Beyond advancing the fundamental understanding of protein photophysics and photoprotection in cyanobacteria, the results also inform the design of artificial light-harvesting systems, synthetic photoprotective materials, and optogenetic tools. By bridging studies of complex biological systems with minimal model proteins, this thesis contributes to the broader field of structural biology, shedding light on the interplay between structure, dynamics, and function in biological macromolecules.