Molecular brain changes in alcohol use disorder and optimization of perfusion fixation method for immunohistochemistry

Abstract

Alkohol, täpsemalt selle psühhoaktiivne toimeaine etanool, on üks enim tarvitatavaid psühhoaktiivseid aineid maailmas ning põhjustab ulatuslikke tervise-, sotsiaalseid ja majanduslikke probleeme. Alkoholitarvitamise häire (Alcohol Use Disorder, AUD) on krooniline haigus, mida iseloomustavad kontrolli kadumine alkoholi tarvitamise üle, tung alkoholi tarvitada ning korduvad ebaõnnestunud katsed tarvitamist vähendada. Käesolev doktoritöö käsitleb AUD-ga seotud molekulaarseid muutusi inimese ajus, keskendudes eeskätt sügavamatele ajustruktuuridele, mille roll alkoholi mõjul kujunevates neurobioloogilistes muutustes on seni olnud vähem uuritud. Geenikiibi analüüs taalamuse mediodorsaalses tuumas näitas, et AUD korral ülesreguleeritud geenid on seotud peamiselt glutamatergilise ja GABAergilise neurotransmissiooni, rakulise metabolismi ning neurogeneesiga, samas kui allareguleeritud geenid seostusid eeskätt immuunsüsteemi protsessidega. Geenikiibi tulemusi hinnati täiendavalt valgu- ja koetasandil. Valitud muutusi kinnitati Western blot analüüsiga ning nende paiknemist ajukoes uuriti fluorestsents-immunohistokeemia abil. Selleks arendati ja optimeeriti kuluefektiivne surmajärgne perfusioonfikseerimise meetod inimajude uurimiseks. Meetod tagas hea koe säilivuse ning näitas, et kuni 37 tunni pikkuse surmajärgse intervalli korral säilib usaldusväärne rakuline struktuur, samas kui pikema aja möödudes hakkab koe kvaliteet märgatavalt halvenema. Immunohistokeemiline analüüs keskendus geenikiibi analüüsi põhjal valitud AUD-ga seotud sihtmärkidele: parvalbumiinile (PV) ja transkriptsioonifaktorile 4 (TCF4). Parvalbumiin-positiivsed interneuronid olid selgelt tuvastatavad inimese hipokampuses ning enamik neist ekspresseeris ka rakuadhesioonimolekuli NEGR1, mida on seostatud alkoholitarvitamise geneetilise riskiga. TCF4 oli laialdaselt ekspresseeritud hipokampuse neuronites, paiknedes nii rakutuumas, rakukehas kui ka dendriitides. Selle ekspressioon oli tugevam hipokampuse CA2/3 piirkonnas ning madalam CA1 piirkonnas, kuid säilis mõlemas ajupoolkeras sarnase mustrina. Kokkuvõttes näitab töö, et AUD-ga seotud geneetilised ja molekulaarsed riskitegurid võivad avalduda närvirakupopulatsioonide tasandil ning mõjutada neuraalsete võrgustike toimimist. Tulemused aitavad paremini mõista alkoholisõltuvuse neurobioloogiat ja loovad aluse täpsemate uurimissihtmärkide määratlemiseks. Lisaks pakub optimeeritud perfusioonimeetod kuluefektiivse lahenduse inimajude kvaliteetsemaks uurimiseks. Alcohol, specifically its psychoactive component ethanol, is one of the most widely consumed substances worldwide and contributes to substantial health, social, and economic burdens. Alcohol use disorder (AUD) is a chronic condition characterized by loss of control over alcohol consumption, craving, and repeated unsuccessful attempts to reduce intake. This doctoral thesis investigates molecular changes associated with AUD in the human brain. Gene expression analysis in the mediodorsal thalamic nucleus revealed that upregulated genes were mainly involved in glutamatergic and GABAergic neurotransmission, cellular metabolism, and neurodevelopment, whereas downregulated genes were primarily related to immune system processes. The gene expression findings were further assessed at the protein and tissue levels. Selected changes were confirmed by Western blot analysis, and their localization in brain tissue was examined using fluorescent immunohistochemistry. For this purpose, a cost-effective post-mortem perfusion fixation method for human brain tissue was developed and optimized. The method ensured good tissue preservation and showed that a post-mortem interval of up to 37 hours maintains reliable cellular structure, whereas longer intervals lead to noticeable tissue degradation. Immunohistochemical analysis focused on AUD-related targets selected from the gene expression data: parvalbumin (PV) and transcription factor 4 (TCF4). Parvalbumin-positive interneurons were clearly identifiable in the human hippocampus, and most of these cells also expressed the cell adhesion molecule NEGR1, which has been linked to genetic risk for alcohol consumption. TCF4 was widely expressed in hippocampal neurons, including nuclei, somata, and dendrites. Its expression was strongest in the hippocampal CA2/3 region and lowest in CA1, while maintaining a consistent pattern across hemispheres. In conclusion, AUD-related genetic and molecular risk factors may manifest at the level of specific neuronal populations and affect neural network function. These findings improve our understanding of the neurobiology of alcohol use disorder and provide a basis for identifying more precise research targets. Furthermore, the optimized perfusion method offers a cost-effective approach for improving the quality of human brain research.