Eukarüootse valgukompleksi Cbf5-Gar1-Nop10-Nhp2 puhastamine ja aktiivsuse kontroll in vitro pseudouridülatsioonil

Abstract

Käesoleva töö eesmärk oli puhastada välja pseudouridülatsiooni teostava Saccharomyces cerevisiae-st pärit H/ACA ribonukleoproteiin-kompleksi valgud ja testida kompleksi aktiivsust in vitro pseudouridülatsioonil. Kompleksi moodustamiseks optimeeriti valkude ekspressioon E. coli ekspressioonitüvedes, puhastati valgud afiinsuskromatograafia meetoditega ning sünteesiti kompleksi kuuluv giid RNA ja pseudouridülatsioonireaktsiooni substraat-RNA kasutades in vitro transkriptsiooni. Moodustatud kompleksi aktiivsust hinnati triitiumi vabanemise kaudu, kasutades triitiumiga märgitud substraat-RNA-d.