Pagaripärmis töötavad selektsioonimarkerid
Pagaripärmis Saccharomyces cerevisiae on positiivsel selektsioonil kasutuses:
1. auksotroofsed markerid (vt. tabel 5).
ADE1 ja ADE2 (ADEnine requiring) geenide poolt kodeeritud valgud osalevad "de novo" puriini biosünteesi rajas. Mutatsioonid nendes geenis põhjustavad adeniini auksotroofsust - Ade-. Vaid nendes ade- mutantides kuhjub vakuooli vaheühend fosfo-ribosüül-amino-imidasool (AIR), mis aeroobselt kasvavates rakkudes oksüdeeritakse punaseks pigmendiks. Seepärast on ade1 ja ade2 mutantide kolooniad punast värvi. Mitokondriaalsed mutandid, kus puudub funktsionaalne hingamsiahel, seda vaheühendit punaseks ei muuda ja tekivavad valged kolooniad. Laialdaselt kasutatakse ka ade2-1 alleeli, mis sisaldab UAA mutatsiooni. Tekkivad kolooniad on punast värvi. UAA stop-koodonit tunneb ära suppressor SUP4-o, mille tulemusena sünteesitakse Ade2 ning kolooniad on valge värvusega. ADE3 geeni poolt kodeeritud C1-tetrahüdrofolaat süntetaas osaleb folaadi biosünteesi rajas. Mutatsioonid selles geenis põhjustavad samuti adeniini auksotroofsust (Ade-) kuid moodustunud kolooniad on valge värvusega (AIR ei kuhju).
LYS2 (LYSine requiring) kodeerib -aminoadipaat reduktaasi, mis katalüüsib viiendat reaktsiooni lüsiini biosünteesi rajas. Mutatsioonid selles geenis põhjustavad lüsiini auksotroofsust - Lys-. lys2 ja lys5 mutantides koguneb toksiline vaheühend ja need rakud on resistentsed
-aminoadipaadi (
-AA) suhtes. Seega saab kasutada
-AA vastuselektsioonil (vt. alapeatükk "Vastuselektsiooni võimaldavad markerid"). Kuna LYS2 geen on suhteliselt suur ning sisaldab palju restriktaaside poolt äratuntavaid järjestusi, siis seda markergeeni väga laialdaselt ei kasutata.
URA3 (URAcil requiring) kodeerib orotidiin-5'-fosfaat dekarboksülaasi, mis katalüüsib kuuendat reaktsiooni "de novo" pürimidiinide bisünteesi rajas. Mutatsioonid selles geenis põhjustavad uratsiili auksotroofsust - Ura-. URA3 markergeen komplementeerib pärmigenoomis olevat ura3 mutatsiooni ning rakud kasvavad söötmel kus puudub uratsiil. URA3 markergeeni vastuselektsioon toimub 5-fluoro-oroothapet (5-FOA) sisaldaval söötmel (vt. alapeatükk "Vastuselektsiooni võimaldavad markerid"). Kuna URA3 geen on suhteliselt lühike ning seda on võimalik selekteerida nii poolt kui vastu, siis kasutatakse URA3 markergeeni väga laialdaselt.
Tabel 5. Pagaripärmi auksotroofsed markergeenid.
Markergeen |
Ensüümi nimi |
Biosünteesi rada |
Sagedamini kasutatavad alleelid |
ADE1 |
N-suktsinüül-5-amino-imidasool-4-karboksamiid ribotiid süntetaas |
"de novo" puriini biosüntees (7. etapp) |
ade1-14 |
ADE2 |
fosfo-ribosüül-amino-imidasool karboksülaas |
"de novo" puriini biosüntees (6. etapp) |
ade2-101, ade2-1 |
ADE3 |
C1-tetrahüdrofolaat süntetaas |
folaadi biosüntees | ade3-1, ade3-3 |
HIS3 |
imidasool-glütserool-fosfaat dehüdrataas |
histidiini biosüntees (6. etapp) |
his3-![]() ![]() |
LEU2 |
![]() |
leutsiini biosüntees (3. etapp) |
leu2-![]() |
LYS2 |
![]() |
lüsiini biosüntees (5. etapp) |
lys2-![]() |
TRP1 |
fosfo-ribosüül-antranilaat isomeraas |
trüptofaani biosüntees (3. etapp) |
trp1-![]() ![]() |
URA3 |
orotidiin-5'-fosfaat dekarboksülaas |
"de novo" pürimidiinide bisüntees (6. etapp) |
ura3-52, ura3-1 |
2. resistentsusgeenid (vt. tabel 6).
KanMX markerit kasutati pagaripärmi ülegenoomse deletsioonikollektsiooni tegemisel. Selleks asendati ükshaaval kõik pagaripärmi genoomis olevad avatud lugemisraamid (ORF) kanMX markeriga ning vaadati nende tüvede kasvu ning elulisust erinevatel kasvutingimustel (erinevad söötmed, erinevad stressifaktorid, erinevad temperatuurid jne.). Sünteetiliste interaktsioonide uurimisel kasutusel olev SGA (Synthetic Genetic Array) meetod kasutab kanMX, natMX ja can1 markergeene.
Tabel 6. Pagaripärmis kasutatavd resistentsusgeenid.
Marker | Selektsioon |
hphMX6 |
hügromütsiin B |
kanMX6 |
genetitsiin |
natMX6 |
nourseotritsiin |
CUP1 |
CuSO4 |
can1 |
kanavaniin sulfaat |