Poolduvas pärmis töötavad selektsioonimarkerid

Poolduvas pärmis Schizosaccharomyces pombe on positiivsel selektsioonil kasutusel:

1. auksotroofsed markerid (vt. tabel 7).

ura4+ geen kodeerib orodiin-5'-fosfaat dekarboksülaasi, mis osaleb pürimidiinide biosünteesi rajas. Mutatsioonid ura4+ põhjustavad Ura- auksotroofsust. Kuna see markergeen on väga laialt kasutusel, siis enamus laboris kasutatavatest tüvedest sisaldavad ura4.d18 retsessiivset mutatsiooni. Pagaripärmi ortoloog URA3 ei ekspresseeru poolduvas pärmis hästi ning komplementeerib ura4- alleele halvasti. Seepärast poolduvas pärmis URA3 markergeeni eriti ei kasutata. ura4+ rakke on võimalik vastuselekteerida kasutades 5-fluoro-oraathapet (5-FOA) (vt. alapeatükki "Vastuselektsiooni võimaldavad markerid"). Söötmetel, mis sisaldab 5-FOA-d, jäävad ellu rakud, kes kaotavad metsiktüüpi ura4+ geeni.

leu1+ kodeerib 3-isopropüülmalaat dehüdrogenaasi, mis osaleb leutsiini biosünteesi rajas. Kuna leu1+ on samuti üks enamkasutatavatest markerites, siis paljud laboritüved omavad leu1.32 alleeli ning on Leu- auksotroofid. Pagaripärmi ortoloog LEU2 komplementeerib poolduva pärmi leu1- mutatsioone juhul kui seda geeni üle-ekpresseerida. Seepärast kasutatakse LEU2 markergeeni kõrge koopia arvuga plasmiidides.

ade6+ kodeerib fosfo-ribosüül-amiino-imidasool karboksülaasi, mis osaleb puriini nukleotiidide biosünteesi rajas. Kuna ade6+ geen sisaldab palju restriktaaside poolt äratuntavaid järjestusi, siis seda markerit väga laialdaselt ei kasutata. Poolduva pärmi ade6- mutandid on sarnase fenotüübiga kui pagaripärmi ade2- mutandid: nad kasvavad söötmel, kus on vähem adeniini (10 mg/l) ja moodustavad punaseid või roosasid kolooniaid. Poolduva pärmi ade6.M210 ja ade6.M216 alleelid komplementeerivad üksteist ning neid kasutatakse diploidsete tüvede isoleerimisel. Mõlemad mutandid on Ade- auksotroofid. Söötmel, kuhu on lisatud vähe adeniini, moodustab ade6-M210 mutant tumeroosad kolooniad ja ade6-M216 mutant heleroosad kolooniad. Diploid ade6.M210/ade6.M216 ei vaja kasvuks söötmes adeniini ning moodustuvad kolooniad on valged. Poolduva pärmi ade6.704 alleel sisaldb nonsense mutatsiooni, mida supresseerib sup3-5 (sup3 kodeerib translatsiooni terminatsiooni faktorit eRF3, sup3-5 aga tRNA-d). Seda markergeeni kasutatakse juhul kui on vaja värvi järgi selekteerida plasmiidi olemasolu rakkudes. Kui ade6.704 rakkudesse transformeerida plasmiid, mis sisaldab sup3-5 alleeli, siis moodustuvad kolooniad on heleroosad. Heleroosat värvust põhjustavad vead plasmiidi pärandumisel. Juhul kui enamus rakke plasmiidi kaotavad, siis moodustuvad tumeroosad kolooniad. Kui sup3-5 alleel integreerida poolduva pärmi genoomi, siis moodustuvad valged kolooniad tänu alleeli 100% pärandumisele.

Tabel 7. Poolduva pärmi auksotroofsed markergeenid.

Markergeen
Ensüümi nimi
Sagedamini kasutatavad alleelid
Pagaripärmi ortoloog
ade6+
fosfo-ribosüül-amiino-imidasool karboksülaas
ade6-M210, ade6-M216, ade6-704
ADE2
arg3+
ornitiin karbamüültransferaas
arg3.d4
ARG3
his1+
ATP fosforibosüül transferaas
his1.102
HIS1
his3+
histidinool-fosfaat aminotransferaas his3.237
HIS5
leu1+
3-isopropüülmalaat dehüdrogenaas
leu1-32
LEU2
ura4+
orodiin-5'-fosfaadi dekarboksülaas
ura4.d18
URA3

 

2. resistentsusgeenid (vt. tabel 8).

Poolduvas pärmis kasutatakse kõige rohkem kanMX6 kassetti, mis koosneb Ashbya gossypii translatsiooni elongatsioonifaktori 1 TEF1 geeni promootori ja terminaatori järjestustest ning Escherichia coli transposooni Tn903 kanR geenist. kanR geen tagab resistentsuse genetitsiini (G418) vastu.

Tabel 8. Poolduvas pärmis kasutatavd resistentsusgeenid.

Marker Selektsioonil kasutatav antibiootikum
Selektsiooniks sobilik sööde
bleMX6
bleomütsiin
ainult rikas sööde
hphMX6
hügromütsiin B
ainult rikas sööde
kanMX6
genetitsiin
ainult rikas sööde
natMX6
nourseotritsiin
rikas sööde ja miinimumsööde