Poolduvas pärmis töötavad promootorid

Poolduva pärmi Schizosaccharomyces pombe ekspressioonisüsteemides kasutatavad promootorid võib jagada:

1. konstitutiivsed promootorid (vt. tabel 11)
Kõige enimkasutatud on alkoholi dehüdrogenaasi adh1+ geeni promootor. See on tugev promootor ning töötab nii glükoosi kui ka glütserooli sisaldavas söötmes.

Tabel 11. Poolduvas pärmis kasutatavad konstitutiivsed promootorid.

Promootor Päritolu Ekspressiooni tase
adh1+ alkoholi dehüdrogenaasi geen
kõrge
SV40 SV40 väike T-antigeen madal
cam1+ kalmoduliini geen
madal
tif51+
translatsiooni elongatsiooni faktor eIF5A geen kõrge
ef1a-c+
translatsiooni elongatsiooni faktor EF-1 geen
kõrge

2. reguleeritavad promootorid (vt. tabel 12)
Geeni nmt1+ promootor oli esimene poolduva pärmi reguleeritav promootor mis kirjeldati 1990. a. ja on siiani kõige enam kasutatud. nmt1+ promootor on represseeritud tiamiini (vitamiin B1) poolt. Promootori induktsiooniks on vaja tiamiin söötmest eemaldada. Selleks pestakse rakke kas steriilse veega või tiamiin mittesisaldava söötmega. Induktsioon võtab aega 16-20 tundi. Aeglase induktsiooni põhjustab rakusisese tiamiini aeglane omastamine. Promootori aktiivsust saab reguleerida ka erineva tiamiini konsentratsiooniga söötmes. nmt1+ promootor töötab vaid miinimumsöötmes. Rikka söötme koostises olev pärmi ekstrakt sisaldab piisaval hulgal tiamiini, et promootorit represseerida. Mutatsioonid nmt1+ promootori TATA järjestus põhjustavad promootori aktiivsuse muutumist. Nii on eraldatud kaks erineva tugevusega promootori varainti - nmt41 on keskmise tugevusega promootor (25x induktsioon), nmt81 on nõrk promootor (7x induktsioon). Kuigi tiamiin represseerib metsiktüüpi nmt1+ promootorit ligikaudu 100x, ei ole see piisav promootori täielikuks "kinni panekuks". Seega on võimalik komplementeerida ka mõningate geenide deletsioone tiamiini juuresolekul.

nmt1+ ekspressioonisüsteemi eelised:

  • on olemas ekspressiooniplasmiidid ja integreerimisvektorid, mistõttu on võimalik kiiresti konstrueerida vajalik tüvi või plasmiid;
  • on võimalik kasutada erineva tugevusega nmt promootori variante, promootori aktiivsust on võimalik reguleerida ka tiamiini kontsentratsiooniga söötmes;
  • promootorit ei ole võimalik täielikult "kinni panna".

nmt1+ ekspressioonisüsteemi puudused:

  • ekspressiooni induktsiooniks on vaja tiamiin söötmest eemaldada;
  • ekspressiooni induktsioon on väga aeglane (ligikaudu 5-6 põlvkonda);
  • reeglina ei saa kasutada rikast söödet, sest see sisaldab tiamiini;
  • promootorit ei ole võimalik täielikult "kinni panna".

Tabel 12. Poolduvas pärmis kasutatavad reguleeritavad promootorid.

Promootor
Päritolu
Regulatsioon
Induktsiooni aeg
Eripära
muudetud CaMV35S
lillkapsa mosaiigiviiruse 35S promootor millele on lisatud Tet repressori seostumise järjestused
tetratsükliini poolt indutseeritav 6-12 tundi
400 x induktsioon
ctr4+-CYC1
pagaripärmi tsütokroom C CYC1 promootorile on lisatud vase transporteri geeni ctr4+ promootoris olevad regulaatorjärjestused
CuSO4 poolt represseeritud 3 tundi  
fbp1+
fruktoos-1,6-bisfosfataasi geeni promootor
glükoosi poolt represseeritud
7.5 tundi
promootor derepresseerub statsionaarse faasi rakkudes
hsp16+
kuumašoki valgu Hsp16 promootor
idutseeritav kuumašoki, etanooli ja oksüdatiivse stressi poolt
3 tundi
promootor derepresseerub statsionaarse faasi rakkudes
inv1+
invertaasi promootor
glükoosi poolt represseeritud
1 tund
ekspressioon ei ole ajas stabiilne
nmt1+
"no message in thiamine" promootor
tiamiini poolt represseeritud
16 tundi
nmt1+ - tugev (300x induktsioon); nmt41 keskmise tugevusega (25x induktsioon); nmt81 - nõrk (7x induktsioon)
nmt185
lühendatud nmt1 promootor
tiamiini poolt represseeritud, 36oC juures represseeritud, 25oC juures indutseeritud
3 tundi
 
urg1+
GTP tsüklohüdrolaas
uratsiili poolt indutseeritav
0,5 tundi